摘要：为了构建能同时独立表达双基因的重组伪狂犬病毒通用转移载体,试验采用前期构建的p UC19-g E/HEK为骨架,将设计合成的独立表达双基因的表达盒(p CMV+MCS1+p CMV+MCS2+BGH p A)克隆至其XbaⅠ位点,获得通用转移载体pg E-CMV2,以多克隆位点限制性内切酶单酶切,并将EGFP基因克隆至MCS1的SpeⅠ/PstⅠ位点、DsRed基因克隆至MCS2的KpnⅠ/XhoⅠ位点,转化BHK-21细胞同时观察荧光。结果表明:多克隆位点限制性内切酶单酶切pg E-CMV2呈现单一条带,EGFP和DsRed均呈现目标荧光,且将两种荧光蛋白分别克隆至同一分子的MCS1与MCS2,两种荧光蛋白均能有效表达。说明pg E-CMV2构建正确,且能独立有效表达双基因,可用于实现将两个或多个外源基因一次重组入PRV基因组中,实现"一针多防"。

摘要：为了获得水牛生长分化因子9(Growth differentiation factor 9,GDF9)重组蛋白质和抗GDF9抗体,根据GDF9基因编码区序列(GenBank:FJ529501.1)设计1对引物,用水牛基因组DNA为模板扩增水牛GDF9成熟肽基因序列,并与其他反刍动物的GDF9成熟肽基因序列进行同源性比较。将该序列克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间以构建重组表达载体,并将重组表达载体转化大肠杆菌*** BL21(DE3),转化菌经IPTG诱导表达重组蛋白质。经Ni-NTA凝胶纯化后的重组蛋白质与矿物油佐剂混合免疫新西兰兔制备抗GDF9抗血清,使用ELISA方法检测血清抗体效价,从抗血清中进一步纯化GDF9抗体。结果显示,成功获得了水牛GDF9成熟肽基因序列,该序列在牛和其他反刍动物之间高度同源。成功构建了重组表达载体并转化大肠杆菌*** BL21(DE3),*** BL21(DE3)经IPTG诱导后表达了分子量为1.96×104的GDF9重组蛋白质,其最高表达量达到菌体蛋白质总量的30%左右。成功制备了抗GDF9抗血清,血清效价达到1∶51 200,抗血清经纯化后得到了高纯度的GDF9抗体。GDF9重组蛋白质和抗GDF9抗体有望应用于提高羊繁殖性能和促进动物胚胎发育的研究和技术开发。

摘要：根据猪卵泡抑素(follistatin,FS)基因编码区序列(GenBank登录号:M36512.1)设计并合成1对引物,经PCR扩增获得了FS基因成熟肽序列,将其克隆入pMD18-T载体并转化*** DH5α感受态细胞,进行PCR、双酶切及测序验证。然后将其克隆到表达载体pRSET-A的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点之间,构建重组质粒pR-FS并转化*** BL21(DE3)感受态细胞,再经PCR、双酶切和测序验证。转化重组质粒pR-FS的重组菌经IPTG诱导后的表达产物进行SDS-PAGE分析,分子质量与预期相符,为26.1ku左右,经0.2mmol/L IPTG诱导3h之后表达量达到最高,约占总菌体蛋白的30%。表达产物可经Ni-NTA凝胶纯化。以上结果表明正确完成了猪FS基因成熟肽序列的克隆及其在大肠杆菌中的表达及纯化。