摘要：目的筛选有效抑制小胶质细胞上脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)表达的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)序列,并观察其对小胶质细胞活性标记物OX-42表达的调节作用。方法设计并合成针对BDNF的siRNA3对(siRNA1588,siRNA283,siR-NA232)及一条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在LipofectamineTM 2000介导下转染小胶质细胞。分别采用Real-TimePCR及Western blot方法测定并比较其抑制率;采用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B,SRB)分析转染复合物的细胞毒性。同时采用免疫荧光组织化学结合共聚焦显微镜观察BDNF和OX-42的表达情况。结果①与阴性对照组及siRNA283、siRNA232相比,BDNFsiRNA1588(50μmol·L-1,脂质体与siRNA比例1∶3)干扰小胶质细胞后,其mR-NA和蛋白的相对表达量最低(P<0.01)。②Lipofectami-neTM 20008μl复合50μmol·L-1siRNA(脂质体与siRNA比例为1∶3),不仅细胞毒性低而且转染效率高(P<0.01),为最佳转染条件。③BNDF和OX-42存在共表达;且siR-NA1588作用后OX-42的平均光密度值(IOD/area)明显降低(P<0.01)。结论①siRNA1588对小胶质细胞上BDNF表达的抑制效果最大。②BDNF在小胶质细胞的活性调节中具有重要作用。

摘要：目的研究多肽MGMT-04模拟O 6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)在人脑胶质瘤原代细胞系SHG-140中抗替莫唑胺(TMZ)耐药的实验。方法首先设计穿膜肽MGMT-04,并加以FITC示踪,再通过免疫荧光定位MGMT-04多肽可以到达细胞核发挥作用。通过流式细胞术检测各处理组SHG-140细胞凋亡的比例,包括正常对照组,MGMT-04多肽组,TMZ组,TMZ+MGMT-04多肽组。通过免疫荧光技术检测上述四组SHG-140细胞BCL2及C-PARP的表达。使用Western Blot法检测上述四组SHG-140细胞中凋亡相关蛋白PARP、Cleaved-PARP、BCL2、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、BAX、BCL2的表达。结果流式细胞术检测结果示正常对照组与MGMT-04多肽组的凋亡无明显差异,TMZ组凋亡细胞比例明显增加,而TMZ+MGMT-04多肽组较TMZ组的凋亡细胞比例下降。免疫荧光染色结果示TMZ+MGMT-04多肽组较TMZ单组BCL2表达高、Cleaved-PARP表达量降低。Western Blot结果进一步验证与正常对照组相比,经MGMT-04多肽单独处理的相关凋亡蛋白的表达无明显差异,而TMZ组较正常对照组的Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3、BAX表达量增加,BCL2的表达量下降,两组之间的差异有统计学意义(P<0.05),而TMZ+MGMT-04多肽组较TMZ组Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3、BAX表达量降低,BCL2表达量升高,两组之间的差异有统计学意义(P<0.05)。结论多肽MGMT-04在人脑胶质瘤原代细胞中具有抗TMZ而增强耐药作用。

摘要：目的筛选有效抑制血管内皮细胞小窝蛋白-1（Caveolin-1）表达的小干扰RNA（smallinterferenceRNA，siRNA）序列，并检测转染复合物的细胞毒性。方法设计合成针对Caveolin-1的siRNA3条（siRNA422，siRNA548，siRNA710）及1条带绿色荧光标记的通用阴性对照FAM-siRNA。在siRNAFect介导下转染血管内皮细胞。用实时荧光定量PCR（Real-timePCR）测定转染后血管内皮细胞中Caveolin-1mRNA的表达，Westernblot方法测定干扰后Caveolin-1蛋白表达，比较抑制率，筛选出有效抑制Caveolin-1表达的siRNA。采用磺基罗丹明B法（sulforhodamineB，SRB）分析转染复合物的细胞毒性。结果①在siRNAFect相同剂量下，siRNA20、30nmol／L组或40nmol／L组转染效率均达到85％以上（P〈0．01）；②siRNAFect 1．3μl复合10nmol／L或20nmol／LsiRNA组细胞存活率均达到80％以上（P〈0．05）；③siRNA548对***926细胞Caveolin-1基因mRNA抑制效果最明显（P〈0．01）；④与阴性对照组及siRNA422、siRNA710相比较，siRNA548干扰血管内皮细胞48h后，Caveolin-1蛋白的表达量最低（P〈0．01o结论①siRNA548 对血管内皮细胞Caveolin-1表达的抑制效果最大。②siRNA浓度20nmol／L复合siRNAFect1．3μl转染效率高，细胞毒性低，适合转染。