摘要：目的检测人胰腺癌 Patu 8988细胞 K-ras 基因点突变形式,并观察针对该点突变的硫代反义寡核苷酸在体内外对 Patu 8988细胞增殖和凋亡的影响。方法顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)法和基因测序检测 Patu 8988细胞 K-ras 点突变形式,根据点突变形式设计并合成硫代反义寡核苷酸(K-ras mutation ASODN)作用 Patu 8988,通过噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞生长情况;流式细胞术(FCM)检测 K-ras 蛋白表达和细胞凋亡;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测K-ras mRNA 表达水平;以 Patu 8988细胞建立裸鼠胰腺癌模型观察 K-ras mutation ASODN 在体内的抗肿瘤效果。结果 PCR-SSP 法和基因测序检测表明 Patu 8988细胞存在 K-ras 基因第12密码子点突变,其突变方式为 GGT→GTT。体外实验表明 K-ras mutation ASODN 组较正义寡核苷酸(SODN)组、随机寡核苷酸(RODN)组和空白对照组可明显抑制 Patu 8988细胞生长(P<0.01),并呈时间-剂量效应关系;转染48 h 后,K-ras mutation ASODN 组的 K-ras 蛋白和 mRNA 表达程度较SODN 组、RODN 组和对照组均明显降低(P<0.01),而细胞凋亡明显增多(P<0.05)。体内实验表明 K-ras mutation ASODN 较 SODN 组、RODN 组和对照组能有效抑制 BALB/C 裸鼠人胰腺癌的生长(P<0.01)。结论针对 K-ras 基因第12密码子点突变的反义寡核苷酸可明显抑制人胰腺癌 Patu8988细胞生长,促进细胞凋亡,其机制可能是通过下调 K-ras 蛋白和 K-ras mRNA 表达而起作用。

摘要：目的检测人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因点突变及其突变方式,明确基因治疗靶点的碱基序列。方法针对K-ras基因第12位密码子点突变方式(CGT、GTT、GAT)设计顺序特异性引物(SSP),对人胰腺癌细胞株Patu 8988进行聚合酶链反应(PCR),扩增产物经12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后判断该细胞株有无K-ras基因点突变及其突变方式。逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因,扩增产物直接进行基因序列测定。结果PCR-SSP法检测人胰腺癌细胞株Patu 8988存在K-ras基因点突变,突变方式为GGT→GTT,其结果与基因序列测定完全相符。结论明确了人胰腺癌细胞株Patu 8988 K-ras基因第12位密码子点突变方式(GGT→GTT),为胰腺癌的下一步基因治疗研究打下了坚实的基础;PCR-SSP方法检测K-ras基因点突变简便、快速、经济且特异性高,有望在临床上成为早期诊断和鉴别诊断胰腺癌的实用检测方法。