摘要：目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)株,为下一步使用低表达Fas基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas基因mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获得重组慢病毒,通过感染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染UCMSCs,应用Real time-PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。

摘要：目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)MMP-9基因对THP-1细胞增殖的抑制作用。探讨RNA干扰MMP-9基因在白血病治疗中的应用。方法:设计合成针对MMP-9基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染THP-1细胞,采用RT-PCR法测定MMP-9 mRNA的表达,Western blot测定MMP-9蛋白的表达,MTT和台盼蓝染色观察RNAi后对THP-1细胞生长的影响,显微镜下观察细胞形态改变。结果:siRNA转染组THP-1细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达受到抑制,显著低于空白对照组和阴性对照组。MTT及台盼蓝染色结果显示,siRNA组转染后48 h、72 h,THP-1细胞的增殖能力明显下降,细胞生长明显受到抑制,细胞活率明显低于对照组(P<0.05)。倒置显微镜下发现,对照组细胞呈半贴壁生长,细胞轮廓清楚,形态均一,生长旺盛。而siRNA组细胞生长呈受抑制状态,Wright染色后观察,siRNA组细胞形态有明显改变,大部分细胞出现凋亡的形态学变化。结论:靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性降低MMP-9 mRNA及蛋白的表达,且能有效抑制THP-1细胞的增殖,促进THP-1细胞凋亡。

摘要：目的构建P75特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促乳腺癌细胞生长及凋亡的影响。方法通过GenBank提供的P75mRNA序列,设计3对能转录短发夹状RNA的DNA序列,构建pSilencerTM4.1-CMV neo质粒重组载体,转染乳腺癌SKBR3细胞;通过实时荧光定量PCR和Western blot筛选RNA干扰效果最强的干扰片段;以此干扰片段转染至乳腺癌SKBR3细胞,利用G418筛选稳定表达P75-siRNA的SKBR3细胞株,命名为P75-siRNA;MTT检测P75干扰后NGF对细胞增殖作用的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;建立荷乳腺癌小鼠模型,观察P75干扰后对小鼠肿瘤生长和凋亡相关蛋白表达的影响。结果序列测定表明成功构建P75-siRNA表达载体,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示P75mRNA和蛋白表达下调,尤以P752-siRNA干扰片段效果显著;MTT检测显示,NGF能刺激细胞增殖,与NGF组相比,P75-siRNA干扰后细胞增殖率均明显增高(P<0.05);与空白对照组相比,NGF+P75-siRNA组和NGF组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05),NGF+P75-siRNA组更为明显;荷乳腺瘤小鼠中,P75-siRNA组小鼠的肿瘤生长明显超过未转染组和空载体转染组(P<0.05),且P75-siRNA组Caspase-3表达下降,Bcl-2表达增加,Bax表达下降(P<0.05)。结论P75特异干扰表达载体能有效降低P75的表达,增强NGF促乳腺癌SKBR3细胞的增殖作用和抗凋亡作用,从而使肿瘤生长更为明显。

摘要：临床血液学检验技术是医学检验技术专业的主干专业课程,主要是以临床血液病为研究对象,涵盖化学、物理、免疫和分子生物学等检验技术和方法,为临床血液病的诊断、治疗和预后判断提供实验依据[1]。临床血液学检验技术是一门多学科交叉课程,具有较强的理论性和实践性,是医学检验技术所有专业课程中与临床实践关联性最为紧密的综合性临床学科[2]。课程中涉及大量的血液和骨髓细胞形态学知识和血液系统疾病相关知识,被学生公认为学习难度最大的专业课程之一[3]。

摘要：目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;采用Wester blot检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。

摘要：临床检验基础是医学检验专业的必修课之一,临床检验基础实验课是其重要组成部分,占有相当重要的比例。因此,实验课教学尤为重要。通过对临床检验基础实验课教学模式、教学内容、教学方法、优化实验设计、加强实验操作等方面进行改革探索,可充分调动学生的学习积极性,切实提高教学质量、学生的实际操作能力及分析问题、解决问题的能力,为培养优秀的医学检验人才打下坚实的基础。

摘要：背景与目的:构建TrKA特异小干扰RNA(si RNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促细胞增殖作用和对细胞周期的影响。材料与方法:通过Genbank提供的TrKA基因mRNA全序列,应用设计软件选择设计能转录短发夹状RNA(short hairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与PsilencerTM4.1-CMV neo质粒载体连接,经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染乳腺癌MCF-7细胞。利用G418筛选稳定表达TrKA-si RNA的MCF-7细胞株,通过Real-ti me PCR、Western blot和免疫组化在mRNA和蛋白水平检测TrKA的表达水平。MTT法检测TrKA干扰后NGF对细胞增殖作用的影响。流式细胞术观察细胞周期的变化。结果:序列测定表明成功构建TrKA-si RNA表达载体,Real-ti me PCR显示TrKA mRNA下调74.7%(P<0.05),Western blot显示蛋白表达下降80.5%,免疫组化结果也显示TrKA蛋白表达下降。试剂盒提供阳性对照GAPDH基因其表达水平下降85.0%(P<0.05)。MTT检测显示,NGF组细胞增殖反应均较NGF+si RNA组、si RNA组和对照组明显升高(P<0.05),NGF+si RNA组的细胞增殖反应较其余各组下降(P<0.05),表明TrKA干扰能有效抑制NGF诱导的乳腺癌细胞MCF-7的增殖。流式细胞术检测细胞周期结果显示:与对照组相比,NGF+si RNA组和si RNA组细胞G0/G1期增加,S期减少(P<0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期。结论:TrKA特异si RNA表达载体有效下调TrKA基因的表达,并抑制NGF引起的细胞增殖效应。

摘要：从NCBI中获得PPE7蛋白的编码基因序列,设计引物从H37Rv基因组中克隆出Rv0354c基因,将其转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中,扩大培养后测序鉴定。同时,运用ORF Finder、BLAST、Protparam、ProtScaleon Expasy、TMHMM Server v.2.0、SignalP4.1 Server、NetPhos3.1 Server、NetAcet1.0 Server、NetNGlyc1.0 Server、SOPMA、SWISS-MODEL、ABCpred、STRING等生物信息学分析工具对PPE7蛋白可能的相关生物学信息进行预测。结果显示,Rv0354c基因成功扩增,测序正确。基因全长426 bp,有2个开放阅读框,其编码蛋白为PPE7,由141个氨基酸组成,等电点为5.45,为疏水性蛋白,跨膜氨基酸数为0.59727,无信号肽、乙酰化位点和N-糖基化位点,有14个磷酸化位点;并且PPE7具有潜在的T、B细胞表位,与多种蛋白质存在相互作用关系,可能为抗结核疫苗的研发提供重要参考。

摘要：目的：探讨病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ（v MIP-Ⅱ）对乳腺癌细胞CXCR4表达的影响及分子机制。方法：设计并合成扩增CXCR4核心启动子基因序列,构建荧光素酶报告载体,酶切鉴定;通过检测报告基因荧光素酶活性反映病毒巨噬细胞炎性蛋白N端21肽（NT21MP）对CXCR4启动子的作用;通过荧光定量PCR技术和Western blot检测CXCR4干扰或过表达、HER-2干扰,以及miRNAs抑制剂和类似物转染后相关基因及miRNAs表达;采用磺酰罗丹明B（SRB）染色法检测细胞增殖活性,PI染色法检测细胞周期,Annexin V/PI染色法检测细胞凋亡。结果：NT21MP下调CXCR4的表达,并上调miR-125b、miR-135a和miR-146a的表达（P〈0.05~P〈0.01）;NT21MP降低CXCR4核心启动子的活性;SP1为CXCR4核心启动子高频结合转录因子,miR-135a可下调SP1的表达（P〈0.01）;过表达CXCR4上调HER-2表达（P〈0.01）,而干扰CXCR4表达则下调HER-2表达（P〈0.01）;miR-125b可下调HER-2的表达（P〈0.01）;HER-2表达下调诱导miR-146a的表达;miR-146a抑制CXCR4表达（P〈0.01）;相对于空白对照组,miR-146a和miR-135a均可抑制细胞增殖,阻断细胞周期,并诱导凋亡（P〈0.01）。结论：NT21MP通过诱导miR-125b、miR-135a和miR-146a负调控CXCR4的表达,从而抑制乳腺癌细胞的增殖能力,为NT21MP应用于乳腺癌患者的治疗提供了理论基础。