摘要：目的应用慢病毒介导的RNA干扰技术,构建Fas基因的siRNA慢病毒表达载体,建立Fas基因稳定干扰的人脐带间充质干细胞(UC-MSCs)株,为下一步使用低表达Fas基因的UC-MSCs治疗再生障碍性贫血奠定实验基础。方法以人Fas基因mRNA序列作为干扰靶点,设计4组靶向Fas的shRNA序列,合成寡核苷酸,与经过BamHI、EcoRI双酶切后的LV3载体连接获得重组慢病毒,通过感染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。体外培养人UC-MSCs,使用包装好的慢病毒感染UCMSCs,应用Real time-PCR和Western blotting检测感染后细胞中Fas mRNA及蛋白的表达情况。结果经酶切以及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,病毒悬液滴度为3×108TU/ml。Real time-PCR和Western blotting结果显示干扰组细胞的Fas表达水平较对照组显著降低。结论慢病毒介导的SiRNA能有效沉默UC-MSCs中Fas基因的表达。

摘要：目的:研究RNA干扰(RNA interference,RNAi)MMP-9基因对THP-1细胞增殖的抑制作用。探讨RNA干扰MMP-9基因在白血病治疗中的应用。方法:设计合成针对MMP-9基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),转染THP-1细胞,采用RT-PCR法测定MMP-9 mRNA的表达,Western blot测定MMP-9蛋白的表达,MTT和台盼蓝染色观察RNAi后对THP-1细胞生长的影响,显微镜下观察细胞形态改变。结果:siRNA转染组THP-1细胞MMP-9 mRNA及蛋白表达受到抑制,显著低于空白对照组和阴性对照组。MTT及台盼蓝染色结果显示,siRNA组转染后48 h、72 h,THP-1细胞的增殖能力明显下降,细胞生长明显受到抑制,细胞活率明显低于对照组(P<0.05)。倒置显微镜下发现,对照组细胞呈半贴壁生长,细胞轮廓清楚,形态均一,生长旺盛。而siRNA组细胞生长呈受抑制状态,Wright染色后观察,siRNA组细胞形态有明显改变,大部分细胞出现凋亡的形态学变化。结论:靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性降低MMP-9 mRNA及蛋白的表达,且能有效抑制THP-1细胞的增殖,促进THP-1细胞凋亡。

摘要：目的构建P75特异小干扰RNA(siRNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促乳腺癌细胞生长及凋亡的影响。方法通过GenBank提供的P75mRNA序列,设计3对能转录短发夹状RNA的DNA序列,构建pSilencerTM4.1-CMV neo质粒重组载体,转染乳腺癌SKBR3细胞;通过实时荧光定量PCR和Western blot筛选RNA干扰效果最强的干扰片段;以此干扰片段转染至乳腺癌SKBR3细胞,利用G418筛选稳定表达P75-siRNA的SKBR3细胞株,命名为P75-siRNA;MTT检测P75干扰后NGF对细胞增殖作用的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;建立荷乳腺癌小鼠模型,观察P75干扰后对小鼠肿瘤生长和凋亡相关蛋白表达的影响。结果序列测定表明成功构建P75-siRNA表达载体,实时荧光定量PCR和Western blot检测结果显示P75mRNA和蛋白表达下调,尤以P752-siRNA干扰片段效果显著;MTT检测显示,NGF能刺激细胞增殖,与NGF组相比,P75-siRNA干扰后细胞增殖率均明显增高(P<0.05);与空白对照组相比,NGF+P75-siRNA组和NGF组的细胞凋亡率明显降低(P<0.05),NGF+P75-siRNA组更为明显;荷乳腺瘤小鼠中,P75-siRNA组小鼠的肿瘤生长明显超过未转染组和空载体转染组(P<0.05),且P75-siRNA组Caspase-3表达下降,Bcl-2表达增加,Bax表达下降(P<0.05)。结论P75特异干扰表达载体能有效降低P75的表达,增强NGF促乳腺癌SKBR3细胞的增殖作用和抗凋亡作用,从而使肿瘤生长更为明显。

摘要：目的:构建人凋亡相关因子(Fas)基因短发夹RNA慢病毒载体,实现沉默人脐带间充质干细胞Fas基因的表达。方法:根据Fas基因mRNA序列,设计4组靶向Fas基因的短发夹RNA序列,合成、退火形成双链DNA片段,与经过DNA内切酶Bam HⅠ、EcoRⅠ双酶切后的LV3载体连接转入感受态细胞,对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性克隆进行测序及比对分析。通过转染293T细胞对慢病毒进行包装和滴度测定。结果:经酶切及基因测序鉴定证明慢病毒载体构建成功,通过荧光显微镜观察证明病毒转入293T细胞,感染效率>90%,并获得高滴度的慢病毒载体,病毒滴度为3×108TU/ml。结论:成功构建人Fas基因RNA干扰慢病毒载体,为下一步转染脐带间充质干细胞提供理论参考。

摘要：目的:构建重组表达人吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)基因的慢病毒载体。方法:设计相应引物,从含有人IDO基因的cDNA文库中,利用聚合酶链反应(PCR)方法钓取人IDO基因的全长编码区片段。将目的基因与经酶切线性化的慢病毒载体pGC-FU进行定向的连接,将产物转化细菌感受态细胞。对长出的克隆进行菌落PCR鉴定,并对阳性的克隆进行测序及比对分析。重组慢病毒及辅助包装质粒共转染293T细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;采用Wester blot检测IDO-GFP融合蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测慢病毒浓缩液的滴度。结果:成功获取人IDO基因编码区序列,人IDO基因慢病毒转染质粒连接正确;293T细胞中产生慢病毒颗粒;IDO基因在细胞内稳定表达;人IDO基因重组慢病毒载体的滴度为2×108TU/ml。结论:成功构建并包装出高滴度的人IDO基因重组慢病毒表达载体,为下一步转染目的细胞奠定了实验基础。

摘要：背景与目的:构建TrKA特异小干扰RNA(si RNA)表达载体,并观察其对神经生长因子(NGF)促细胞增殖作用和对细胞周期的影响。材料与方法:通过Genbank提供的TrKA基因mRNA全序列,应用设计软件选择设计能转录短发夹状RNA(short hairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与PsilencerTM4.1-CMV neo质粒载体连接,经DNA测序鉴定重组体DNA序列正确后转染乳腺癌MCF-7细胞。利用G418筛选稳定表达TrKA-si RNA的MCF-7细胞株,通过Real-ti me PCR、Western blot和免疫组化在mRNA和蛋白水平检测TrKA的表达水平。MTT法检测TrKA干扰后NGF对细胞增殖作用的影响。流式细胞术观察细胞周期的变化。结果:序列测定表明成功构建TrKA-si RNA表达载体,Real-ti me PCR显示TrKA mRNA下调74.7%(P<0.05),Western blot显示蛋白表达下降80.5%,免疫组化结果也显示TrKA蛋白表达下降。试剂盒提供阳性对照GAPDH基因其表达水平下降85.0%(P<0.05)。MTT检测显示,NGF组细胞增殖反应均较NGF+si RNA组、si RNA组和对照组明显升高(P<0.05),NGF+si RNA组的细胞增殖反应较其余各组下降(P<0.05),表明TrKA干扰能有效抑制NGF诱导的乳腺癌细胞MCF-7的增殖。流式细胞术检测细胞周期结果显示:与对照组相比,NGF+si RNA组和si RNA组细胞G0/G1期增加,S期减少(P<0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期。结论:TrKA特异si RNA表达载体有效下调TrKA基因的表达,并抑制NGF引起的细胞增殖效应。

摘要：目的:阐明病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(virus macrophage inflammatory protein-Ⅱ,v MIP-Ⅱ) N末端21个氨基酸的多肽(NT21MP)对乳腺癌MCF-7细胞miRNAs表达谱的调控作用。方法:收集各组细胞抽提RNA,RNA质量评估后逆转录成c DNA。采用染料法(SYBR GreenⅠ)进行相对定量分析,实验按照2-△△Ct解析法进行设计。结果:总共检测了168个miRNAs,以上调> 2倍或下调<0. 5倍筛选。相对于S组,N组升高的有9个:miR-223、miR-451a、miR-128、miR-489、miR-141、miR-320a、miR-155-3p、miR-335、miR-320e,降低的有2个:miR-15a、miR-339。结论:筛选得到NT21MP调控miRNAs差异表达谱,其为研究miRNAs在NT21MP调控中的作用机制提供依据。