摘要：根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入***21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。根据跨膜区预测结果,设计ImpF1/ImpR1和ImpF2/ImpR2两对特异性引物。以ImpF1/ImpR1,ImpF1/ImpR2,Imp-F2/ImpR1和ImpF2/ImpR2共4个组合经PCR扩增得到4个目标片段,即:免疫膜蛋白Imp基因的全长(Imp-B);切除C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-N);切除N-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-C);切除N-和C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)。经酶切连接到原核表达载体Pmal-c2x,并转入***21(DE3)PlysS菌株中。SDS-PAGE电泳验证,只有切除N-、C-端跨膜区的Imp基因的基因序列(Imp-S)得到大量表达,结果表明:小麦蓝矮植原体免疫膜蛋白的跨膜区影响其在大肠杆菌中的表达。

摘要：本研究针对同一目的基因设计构建不同茎部长度的shRNA表达载体,并对其在细胞及胚胎水平的干扰效应做一比较。以绿色荧光蛋白基因为沉默效应的靶基因,设计茎部长度分别为21bp、27bp、29bp的干扰片段,退火后连入带有H6启动子的真核表达载体psiSTRIKE中(分别命名为EGFP-21siRNA、EGFP-27siRNA和EGFP-29siRNA),将构建成功的载体以脂质体法转染小鼠胚胎成纤维细胞,利用荧光定量PCR对其荧光表达进行精确定量。不同茎部长度的shRNA载体均使绿色荧光蛋白基因表达降低,茎部为29bp时比21bp、27bp表现出更明显的沉默效应。细胞水平沉默效应的初步验证,为筛选适合小鼠个体水平的最佳发夹结构奠定了基础。

摘要：为探讨CHS基因的下调表达对花朵着色的影响以及为百合观赏性状遗传改良提供技术支持,利用基于同源重组原理的Gateway技术,根据课题组从东方百合‘索邦’分离的LCHS2基因序列(Genbank登录号:GQ483376)和pENTR/D-TOPO载体要求,设计上游5'端添加'CACC'的一对特异引物,PCR扩增获得636 bp的干扰片段。通过TOPO克隆,将该片段克隆入载体pENTR/D-TOPO构建入门克隆载体pENTR/D-CHS,测序结果显示,与原序列同源性为100%。再经过LR反应使pENTR/D-CHS上的干扰片段替换掉目标载体pHellsgate12上的ccdB片段,快速构建了包含LCHS2基因干扰片段的RNAi表达载体pH12-CHSi,经限制性内切酶XhoI、XbaI酶切鉴定获得724 bp和722 bp的片段,与预期结果一致。pH12-CHSi电击法转化农杆菌GV3101,菌液PCR鉴定,出现636 bp的目的条带,表明RNAi表达载体pH12-CHSi已成功转入农杆菌。

摘要：根据从本课题组前期构建的中国野生葡萄华东葡萄株系白河-35-1在白粉病诱导下的cDNA文库中获得的1条与抗白粉病相关的EST序列,设计特异引物,结合RACE(Rapid-amplrfication of cDNA ends)技术克隆了中国野生华东葡萄白河-35-1广泛逆境蛋白基因(Universal stress protein,USP)全长序列。该基因全长836 bp,编码175个氨基酸,GenBank登录号为GU946975。进一步研究该基因在白粉菌诱导下的相对表达水平,我们通过半定量RT-PCR技术,研究了VpUSP在中国野生华东葡萄抗病、感病株系中的表达变化,结果表明,广泛逆境蛋白在中国野生华东葡萄感病株系中,接种白粉病前后均有表达,但表达量变化不明显;然而,抗病的中国野生华东葡萄株系在接种白粉病后VpUSP基因表达量呈明显的增加趋势,初步表明中国野生华东葡萄VpUSP基因在与白粉病菌互作过程中具有表达活性。

摘要：为了研究硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)基因对肌间脂肪组织三酰甘油形成的影响,试验采用克隆隆林山羊SCD基因CDS区序列并进行序列分析的方法,根据Gen Bank中收录的西农萨能羊SCD序列设计引物并进行PCR扩增及克隆测序,利用在线生物信息学软件分析SCD蛋白的序列特性,分析不同物种间SCD基因的进化关系及三级结构,从而预测隆林山羊SCD基因的功能。结果表明:隆林山羊SCD基因CDS区序列全长1 080 bp,由4个外显子组成,编码359个氨基酸,与牛、绵羊、人的氨基酸相似度分别为94.2%、98.3%、83.8%,并与牛和人具有相似的三级结构。系统进化树显示,隆林山羊与绵羊和牛具有较近的亲缘关系,而与鸡的亲缘关系较远。

摘要：通过用2种RNA提取方法提取甜樱桃植株样品总RNA,并对其进行电泳分析.结果表明,用方法A提取的RNA完整性比方法B较好,出现了较为典型的RNA带型.以方法A提取的甜樱桃总RNA为模板,用设计一对特异性引物进行RT-PCR反应,可见其DNA谱带与预期的一对引物应扩增的片断吻合,说明PCR检测是特异的.通过30份样品经RT-PCR扩增有2份表现出清晰、明显的特异带,占总样品数的6.7%.

摘要：【目的】分离、培养奶山羊骨髓间质干细胞(MSCs),探讨其生物学特性,为心血管、神经退化,尤其是不育症患者的细胞移植治疗及相关细胞发育分化研究奠定基础。【方法】采用贴壁培养法进行MSCs的分离和培养,通过形态学观察、生长曲线测定、免疫细胞化学染色和RT-PCR技术等进行检测;并采用免疫细胞化学法对自发分化的细胞及定向诱导分化的神经样细胞、心肌样细胞、生殖样细胞进行检测,计算生殖样细胞的阳性率。【结果】分离得到的MSCs为成纤维样细胞,其增殖能力强,无致瘤性,已连续传代至22代;其表达胚胎干细胞(ESCs)的表面标记Oct4、Nanog、C-myc和TERT;MSCs形成类胚体自发分化的细胞表达3胚层特异标志基因AFP、β-ⅢTubulin和心肌α-actin;MSCs经β-巯基乙醇诱导,定向分化为表达Nestin和β-ⅢTubulin的早期神经样细胞,经5-氮胞苷(5-Aza)诱导,可定向分化为表达CT3及心肌α-actin的心肌样细胞,并出现肌管样结构,经维甲酸(RA)诱导,分化的细胞表达生殖细胞减数分裂前期的蛋白Vasa、Scp3和CD49f(α6整合素)等生殖细胞标记,其阳性率分别达到35.7%,24.0%和14.0%。【结论】自奶山羊骨髓分离得到MSCs,其具备间质干细胞的基本特性,并具有向神经细胞、心肌细胞、生殖细胞分化的潜能。

摘要：依据报道的ArMV外壳蛋白基因(coat protein,cp)序列设计引物,通过RT-PCR扩增得到长约990bp的ArMV cp基因亲水基团部分片段,将目的片断克隆到原核表达载体pEGX-6p-1中,构建ArMV cp基因与GST蛋白融合表达载体pEGX-cp,重组载体化大肠杆菌BL21,经IPITG诱导后,融合蛋白GST-cp得到了特异表达。用12%的SDS-PAGE分析结果表明,表达产物大小为63.2 kDa主要以包含体的形式存在。用冰冷的KCl显色,分离表达的蛋白质特异条带制备抗体,免疫家兔后得到特异性较强的抗血清,经酶联免疫法检测效价为1∶100 000。

摘要：根据GenBank已收录的牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)等物种Ets-1基因序列的同源保守区域,设计特异性引物,采用RT-PCR和RACE技术,分离并克隆了西农萨能奶山羊(Capra hircus)Ets-1基因的cDNA序列。该序列全长2 263 bp(GenBank登录号HQ589338),包括5'UTR 331 bp,CDS 1 326bp和3'UTR 606 bp,编码441个氨基酸组成的蛋白质。核苷酸序列分析发现,山羊编码序列与牛、猪、人、小鼠等的相应序列同源性分别为98%、94%、92%和90%,3'UTR相应序列为96%、83%、81%和77%,5'UTR相应序列为98%、85%、82%和71%。氨基酸序列分析发现,山羊与牛、猪、人和小鼠的Ets-1的相似性较高,均在95%以上。蛋白质结构分析发现,其蛋白质分子量为50 340.8 D,等电点为5.08,具有典型的螺旋-转角-螺旋结构域,不存在跨膜结构,并且整个序列不含信号肽。

摘要：为了克隆牛Klf4基因并构建重组反转录病毒载体,得到稳定的产毒细胞株,本研究设计了带有酶切位点的一对引物,以接触抑制生长状态的MDBK细胞为材料,用RT-PCR方法克隆出牛Klf4基因的开放阅读框序列,将之插入干细胞反转录病毒载体pMSCVneo构成真核表达载体pMSCV-Klf4;采用脂质体法将pMSCV-Klf4转染包装细胞PT67,通过G418筛选得到稳定的产毒细胞株,电镜观察培养液上清中的病毒颗粒,同时病毒感染NIH3T3细胞测定其病毒滴度。结果表明,本研究克隆的牛Klf4基因开放阅读框序列与已发表序列(NM-001105385)比对有99.9%的高同源性;构建的重组载体质粒可正常包装,电镜下可观察到典型的病毒颗粒,筛选出的产毒细胞株病毒滴度达7.16×107CFU·mL-1。本研究成功构建的真核表达载体pMSCV-Klf4和得到的产毒细胞株,为进一步开展有关牛iPS细胞的研究奠定了基础。