摘要：在哺乳动物细胞中进行基因敲入通常采用同源定向修复(homology-directed repair,HDR)机制将外源DNA模板整合到目标基因组靶点中。然而HDR效率往往较低,其中外源DNA模板与目标基因组靶点的共定位是关键限制因素之一。为提高CRISPR/Cas9系统介导的HDR效率,本团队及前人研究将不同接头蛋白与SpCas9蛋白融合表达,利用其与特异性DNA序列结合的特性,构建了多种CRISPR/SpCas9供体适配基因编辑系统。为了便于比较、优化不同CRISPR/Cas9供体适配系统,本研究利用这些系统在HEK293T细胞GAPDH和ACTB基因末位外显子3′-端进行了eGFP基因敲入,并采用了优化的供体DNA模板设计方式,通过PCR和Sanger测序检测敲入的准确性,流式细胞分析进行敲入效率的检测。结果表明,将yGal4BD、hGal4BD、hLacI、hTHAP11和N57等接头蛋白与SpCas9蛋白C-端融合对其活性均无显著性影响;在GAPDH位点上,SpCas9融合yGal4BD、hGal4BD、hLacI和hTHAP11的供体适配系统等均能显著提高敲入效率;在ACTB位点上,SpCas9融合yGal4BD和hGal4BD能显著提高敲入效率;且增加供体DNA模板中的结合序列(binding sequence,BS)数量,有利于提高SpCas9-hTHAP11系统介导的敲入效率。总之,本研究比较并优化了不同的CRISPR/Cas9供体适配基因编辑系统,为后续相关的基因编辑应用研究提供了参考和借鉴。

摘要：本研究旨在辅助羊场生产数据规范化管理及良种繁育智能科学化应用,采用MySQL数据库及Java、R编程语言,基于Spring Boot+Vue框架设计了一套羊场综合管理系统软件。该系统优化了羊只信息管理、羊场配种方案,实现生产数据可视化,设置预警功能帮助羊场及时掌握羊只产羔时间与生产性能情况;系统设计羊只基本信息管理、生产信息、疫病信息、繁殖信息、药品管理、饲料管理、统计报表与预警、科学育种八个模块。其中,在科学育种管理子模块中,根据羊场育种需求,构建了三种育种值计算模型(BLUP模型、GLMM模型、平均表现型模型),结合种公母羊实际表现,实现种公母羊的等级排序并自动生成近交系数,得到科学合理的配种方案。本系统在陕北某集约化肉羊场、横山区某绒山羊养殖联合育种户、富平县某奶山羊养殖场进行为期半年的实际生产应用,通过跟踪核心群体,完善与优化系统各项功能,为羊场智慧化、数字化育种管理提供了数据平台,同时也为实现智慧羊场的发展增添了新版本1.0。

摘要：为了构建绵羊PLC-γ1基因shRNA慢病毒干扰载体,并在人胚肾细胞(HEK-293T细胞)中筛选及鉴定载体干扰效果,试验采用Invitrogen BLOCK-iTTM RNAi Designer在线软件设计PLC-γ1基因的4条shRNA干扰序列(PLC-γ1-shRNA-1~4)和1条阴性对照序列(PLC-γ1-shRNA-NC),将其分别克隆至慢病毒干扰载体pLentiLox3.7(pLL3.7)中构建PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体,用其转染HEK-293T细胞,48 h后通过倒置荧光显微镜观察荧光蛋白表达情况,并利用实时荧光定量PCR法和Western-blot检测HEK-293T细胞中PLC-γ1基因和蛋白质的表达情况,筛选出干扰效率最高的PLC-γ1-shRNA干扰序列并计算慢病毒含量。结果表明:试验成功设计出PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体,大小为120 bp。PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体均具有较高的干扰效率,在倒置荧光显微镜下均可观察到绿色荧光蛋白表达,其中PLC-γ1-shRNA-2序列的干扰效率最高,其PLC-γ1基因和蛋白质的相对表达量最低,极显著低于PLC-γ1-shRNA-NC的干扰(P<0.01),慢病毒含量为1.1×10^(7)IU/mL。说明针对PLC-γ1基因筛选出的PLC-γ1-shRNA慢病毒干扰载体从基因和蛋白质水平上均能有效地抑制PLC-γ1的表达。

摘要：随着动物功能基因组研究以及高通量组学技术的发展,畜禽育种已经从基于表型的选择方法过渡到以分子标记技术、基因编辑技术等分子生物学技术手段为主的现代育种新策略上。生物育种是现代生物技术育种的统称,是衡量农业科技竞争力的重要标志,包括标记辅助选择、全基因组选择育种、转基因和基因编辑育种、胚胎工程技术体系等育种手段。生物育种作为畜禽遗传改良的重要手段持续推动着我国的种质资源创新。本文详细介绍了生物育种的关键技术及其特点,包括不同育种方法在畜禽种质开发和遗传改良上的研究进展,探讨分析了当前畜禽育种的现状与问题,以期实现生物育种核心技术的突破与发展。

摘要：抗菌脂肽表面活性素是一种环脂肽型生物表面活性剂,具有较强的抑菌、抗病毒、抗肿瘤、抗支原体和诱导植物抗病性等活性,在食品、生物医药和农业等方面具有广泛的应用潜力,然而其产量较低,限制了其商业价值。以枯草芽孢杆菌菌株SFP03为表面活性素表达菌,应用Box-Behnken实验设计和响应面法来系统优化表面活性素的发酵工艺,发现谷氨酸添加量6 g/L,发酵温度32℃,发酵转速206 r/min,发酵36 h后发酵液中生物表面活性素溶血圈直径达到1.70 cm,比优化前提高了17.24%,产量显著提高。研究成果为表面活性素的规模化生产提供了理论支撑和技术基础。

摘要：[目的]为探讨酿酒酵母培养物对泌乳牛血清指标、免疫因子及瘤胃微生物的影响;[方法]采用单因子配对试验设计方法。[结果]试验组血清白蛋白含量(40.68)显著高于对照组(40.07,P<0.05),添加酿酒酵母培养物(sc)血清白蛋白含量,谷丙转氨酶、总蛋白、β-羟基丁酸平均值(29.92、74.10、0.32)显著低于对照组(30.60、77.47、0.37,P<0.05),降低了奶中体细胞的数量,提高机体免疫力;试验组瘤胃液中的菌群多样性逐渐增加(P<0.05)奶牛瘤胃菌群的相对丰度发生了变化,降低了变形菌门和厚壁菌门的比例,增加了拟杆菌门的比例;[结论]日粮中添加SC增加了血清白蛋白含量,降低了谷丙转氨酶、总蛋白、β-羟基丁酸值,提高了机体免疫力、增强了肝细胞保护力,降低了奶中体细胞数量;降低了变形菌门和厚壁菌门的比例,增加了拟杆菌门的比例。

摘要：近年来,CRISPR基因编辑及衍生技术迅速发展,在生命科学、生物医学研究以及动植物育种领域得到了广泛应用。基于DNA双链断裂(double-stranded break,DSB)同源指导修复(homology-directed repair,HDR)机制的基因敲入和点编辑是基因编辑的重要策略,但效率偏低亟待提高。本文提出了驱动供体DNA富集至DSB处以提高HDR效率的新策略,并设计了一套CRISPR/Cas9-Gal4BD供体适配基因编辑系统(donor adapting system,DAS)。该系统主要利用Gal4 DNA结合域(Gal4 binding domain,Gal4BD)作为配体蛋白与Cas9融合表达,将Gal4BD结合序列(Gal4 binding sequence,Gal4BS)作为受体序列与双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体结合,以期提高HDR效率。使用***报告细胞系的初步研究结果表明当dsDNA供体同源臂在一定长度(100~60 bp)时该系统能够提高HDR效率2~4倍。进一步的优化研究表明,融合端口和融合使用连接子(linker)的选择会影响Cas9表达效果及活性,而GGS5作为Cas9-Gal4BD融合的连接子则影响较小。同时,本研究还发现Gal4BS-dsDNA供体的差异化设计也会影响HDR效率,将Gal4BS添加到dsDNA供体5′-端的效果最佳。综上所述,本研究利用CRISPR/Cas9-Gal4BD DAS在AAVS1和EMX1位点上实现了HDR编辑效率的提高,为进一步利用该系统进行动物分子设计育种研究提供了参考和借鉴。

摘要：在CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑中,借助于双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)供体模板的重组效应能够实现对目标基因组靶位点的精确编辑和基因敲入,然而高等真核生物细胞中同源重组的低效性限制了该基因编辑策略的发展和应用。为提高CRISPR/Cas9系统介导dsDNA供体模板的同源重组效率,本研究利用大肠杆菌(Escherichia coli)乳糖操纵子阻遏蛋白LacI与操纵序列LacO特异性结合的特点,通过重组DNA技术将密码子人源化优化的阻遏蛋白基因LacI分别与脓链球菌(Streptococcus pyogenes)源的SpCas9和路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)源的SlugCas9-HF融合表达,通过PCR将操纵序列LacO与dsDNA供体嵌合,构建了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配系统(donor adapting system,DAS)。首先在报告载体水平上对Cas9核酸酶活性、DAS介导的同源引导修复(homology-directed repair,HDR)效率进行了验证和优化,其次在基因组水平对其介导的基因精确编辑进行了检测,并最终利用CRISPR/SlugCas9-hLacIDAS在HEK293T细胞中实现了VEGFA位点的精确编辑,效率高达30.5%,显著高于野生型。综上所述,本研究开发了新型的CRISPR/Cas9-hLacI供体适配基因编辑系统,丰富了CRISPR/Cas9基因编辑技术种类,为以后的基因编辑及分子设计育种研究提供了新的工具。

摘要：为准确实时跟踪羊只目标,进行疾病异常预警,实现奶山羊精细化养殖,本文基于DiMP跟踪模型,利用奶山羊跟踪对象单一且图像样本丰富的特点,结合迁移学习和类特定融合方法,设计了一种类特定的奶山羊目标跟踪模型,能够有效克服DiMP算法在跟踪类特定目标时定位精度不足的缺点。利用构建的奶山羊视频跟踪数据训练集对跟踪算法进行迁移训练,加快模型收敛速度,使评估网络预测出的边界框更贴合奶山羊真实框的位置和尺寸。在线跟踪阶段,针对目标模板仅采用第1帧特征制作整个序列的调制向量,导致该调制向量相对整个跟踪阶段特征不具代表性,与后续帧差异大的缺点,使用训练集制作包含奶山羊各种姿态的类调制向量,以指数消融方式更新奶山羊类调制向量与第1帧调制向量间的比重,增强边界框回归任务中的奶山羊特征与背景的判别性。提出的算法在测试集上的AUC(Area under curve)和精准度(Precision)分别为76.20%和60.19%,比DiMP方法分别提升6.17、14.18个百分点,跟踪速度为30 f/s,满足实时跟踪的要求。实验结果表明,提出的类特定奶山羊目标跟踪方法可用于监测复杂场景下奶山羊的运动,为奶山羊精细化管理提供了技术支持。

摘要：旨在研究日粮中添加过瘤胃保护烟酸(rumen-protected niacin,RPN)和过瘤胃保护胆碱(rumen-protected choline,RPC)对围产期奶牛泌乳性能和肝脂质代谢的影响,为缓解奶牛脂肪肝提供理论依据。本试验选用24头健康、胎次相近的中国荷斯坦围产期奶牛,根据2×2试验设计分为4组,每组6头。处理组分别为对照组(CON,基础日粮)、烟酸组(RPN,基础日粮+18.4 g·d^(-1)RPN)、胆碱组(RPC,基础日粮+60 g·d^(-1) RPC)、混合组(RPN×RPC,基础日粮+18.4 g·d^(-1)RPN+60 g·d^(-1) RPC)。试验期为产前14 d到产后21 d。试验期记录奶牛产后每周体重和产奶量、犊牛初生重,并采集每周血样、产后14和21 d乳样,于产后21 d活体穿刺采集肝组织样品。结果表明,添加RPN和RPC对产后奶牛体重、犊牛初生重、产奶量和乳成分无显著影响(P>0.05);添加RPN和RPC可极显著提高血浆中烟酸(niacin,NA)、胆碱(choline,CH)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)的含量(P<0.001);单独添加RPN和同时添加RPN和RPC可显著降低肝中甘油三酯(triglycerides,TG)的含量(P<0.05)。综上所述,围产期奶牛基础日粮中添加RPN和RPC对生产性能无显著影响,但可通过显著提高血浆中VLDL的含量,降低肝中脂沉积,从而改善围产期奶牛肝和机体健康。