摘要：【目的】鸽腺病毒感染在全球鸽群中广泛分布,可引起多种临床症状,如呕吐、腹泻、肝脏损伤等,严重影响鸽的健康与养殖效益。建立一种快速高效检测鸽腺病毒Ⅰ型(PiAdV-Ⅰ)TaqMan探针实时荧光定量PCR方法,为鸽腺病毒Ⅰ型临床检测及流行病学调查提供技术平台。【方法】依据GenBank公布鸽腺病毒Ⅰ型Hexon基因保守区设计引物探针并构建重组质粒pCE2-TA-PiAdV-Ⅰ;优化反应体系和程序,绘制标准曲线、特异性、敏感性和重复性评价,建立鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法;扩增测序阳性临床样品的Hexon基因,使用MEGA5.0进行进化树构建及同源性分析。【结果】该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法标准曲线y=-3.1081x+37.374,线性相关系数R2为0.9977,线性关系良好;与鸽疱疹病毒、鸽圆环病毒等鸽子其他常见病毒无交叉反应,具有良好的特异性;最低检测拷贝数为14.6 copies/μL,敏感性是常规PCR方法的10倍,具有高敏感性;组内和组间变异系数均低于1.1%,重复性好。通过检测112份鸽子病料样品,该TaqMan探针实时荧光定量PCR方法检测阳性率为69.64%(78/112),并且高于常规PCR方法阳性检出率65.18%(73/112)。此外,建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR方法与常规PCR方法的阳性符合率为100%,总体符合率为95.54%。3条测序毒株与Ⅰ型鸽腺病毒参考毒株同源性为99.47%~99.71%,遗传关系高度接近,表明可能由同一个原始毒株进化而来。【结论】研究建立的鸽腺病毒Ⅰ型TaqMan探针实时荧光定量PCR检测方法线性关系良好、特异性强、敏感性高及重复性好,可快速高效检测出临床样品中的PiAdV-Ⅰ。此外,所扩增序列能够用于分析临床毒株遗传进化特征,有助于快速准确诊断鸽腺病毒感染及疫苗研发提供参考依据。

摘要：为构建脑心肌炎病毒VP2 2A基因真核表达载体。参考EMCV毒株基因组序列,设计VP2 2A基因特异性引物,PCR扩增VP22A基因目的片段,双酶切目的基因和pc DNA3.1-Flag质粒产生相同的黏性末端,使用T4 DNA连接酶连接相同的黏性末端,连接产物转化至DH5α感受态细胞,菌液PCR鉴定阳性单克隆菌落,对阳性单克隆提取重组质粒并双酶切进行验证,对阳性重组质粒进行测序。重组质粒双酶切和测序结果表明,pc DNA3.1-Flag-VP2和pc DNA3.1-Flag-2A真核表达载体构建成功。

摘要：病毒样颗粒是由结构蛋白组装而成,形态结构与天然病毒高度相似的一种多聚蛋白纳米结构,但不包含任何遗传物质,因此是一种理想的疫苗形式。大肠杆菌表达系统因具有良好的安全性、生产周期短、易于放大培养等优点,被广泛应用于基因工程药物的生产,在病毒样颗粒疫苗应用上具有良好前景。本文综述了利用大肠杆菌系统表达的病毒样颗粒及其组装、表位结构特征和临床试验结果等研究进展,以期为病毒样颗粒疫苗的生产提供可靠的数据支持和设计思路。

摘要：研究乳酸菌、乳酸菌与酵母菌混合菌剂以及黑曲霉对藜麦秸秆发酵饲料品质的影响,为藜麦秸秆在饲用方面的开发利用提供参考。利用微生物发酵以期改善藜麦秸秆的营养价值。乳酸菌单一发酵时,设定发酵时间、含水量和菌剂添加量3个试验因子,乳酸菌与酵母菌混合菌剂发酵藜麦秸秆试验中设定发酵时间、含水量和混合比例3个试验因子,均采用L_(9)(3^(4))正交原理设计试验,对粗纤维、粗蛋白、粗脂肪和可溶性糖4个营养指标做响应面法处理。同时做了黑曲霉对藜麦秸秆发酵饲料的对比试验。1)相同发酵条件下,混合制剂降解纤维素的作用比单一发酵剂明显;2)发酵处理后的藜麦秸秆饲料较未发酵的藜麦秸秆粗蛋白平均含量提高了约2.70%;3)发酵过程中粗脂肪含量变化较小,在0.24%~0.31%;4)发酵处理后,藜麦秸秆可溶性糖含量提高了约3%;5)黑曲霉具有明显的降解纤维素和提高可溶性糖含量的作用,但黑曲霉发酵的饲料感官品质较差。微生物发酵对藜麦秸秆饲料品质具有一定的提升作用,一定条件下,混合菌协同发酵优于单一菌株发酵。

摘要：为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3. 937×10~8～3. 937×10~3拷贝·μL^(-1)范围内呈良好的线性关系,R^2可达0. 999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3. 937×10~2拷贝·μL^(-1);组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。

摘要：甲型和乙型流感病毒(Influenza A and B viruses, IAV, IBV)作为季节性流感的主要病原体,在人和动物中流行可造成较高的发病率和死亡率。目前,接种疫苗仍然是预防和控制流感最有效的方法。流感疫苗接种主要是诱导产生病毒中和抗体来抵抗流行毒株对机体的侵染。随着对流感病毒与机体免疫系统研究的不断深入,特异性T细胞免疫反应在预防流感病毒侵染机体过程中发挥的作用越来越被学者所关注。因此,明确机体特异性CD4^(+)和CD8^(+)T细胞抗流感病毒侵染的作用机制,并了解对其作用有影响的各种因素,这将有助于科研人员在流感疫苗设计过程中更加兼顾新型疫苗在激活特异性T细胞反应性能上的提升,为设计出可诱导强大、广谱而持久免疫活性的新型流感疫苗提供依据。

摘要：【背景】碱性蛋白酶是众多芽胞杆菌的发酵产物,是工业上极其重要的一类酶。【目的】利用酪素培养基从环境样品中筛选出一株产碱性蛋白酶的菌株,对传代次数、发酵的碳源、氮源、金属离子、磷酸盐、初始pH、接种量和温度进行优化,提高其产碱性蛋白酶的能力并降低发酵成本。【方法】采用革兰氏染色法、扫描电镜、生理生化试验、16S rRNA基因序列对分离的菌株进行鉴定;采用单因素、Plackett-Burman、最陡爬坡和响应面试验优化碱性蛋白酶的发酵条件,使用Minitab对试验数据进行分析。【结果】经鉴定分离菌株为地衣芽胞杆菌,命名为Bacillus licheniformis NWMCC0046。优化后的发酵培养基组成为(g/L):豆粕50.00,葡萄糖10.00,酵母浸膏13.46,CaCl_(2)0.50,Na_(2)HPO_(4)·12H_(2)O 4.00,KH_(2)PO_(4)0.30;优化后的培养条件为:pH 7.5,34.81℃,接种量4.13%。在此条件下,摇瓶发酵48 h时碱性蛋白酶活性达到165.41 U/mL,较优化前提高了8.04倍。【结论】通过发酵培养基组成和条件优化有效提高了地衣芽胞杆菌产碱性蛋白酶的能力,为碱性蛋白酶的后续研究提供了参考。

摘要：为建立一种快速、高效检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的实时荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank公布的中国流行PRRSV病毒株基因序列,制备包含PRRSV ORF7基因的重组质粒标准品,同时,针对PRRSV保守区域ORF7基因序列设计特异性引物和探针,并优化引物和探针终浓度,建立PRRSV Taq Man实时荧光定量PCR检测方法。以质粒标准品为模板构建检测方法线性模型,评估灵敏度、重复性和特异性,并在疑似临床样品中初步应用。本研究建立的PRRSV Taq Man荧光定量PCR检测方法线性关系良好,线性决定系数为0.9975;病毒载量检测限度为1μL 3.32×10^(1)拷贝;变异系数在组内和组间重复中均小于1.500%;仅与PRRSV发生特异性反应,未与其他病毒发生交叉反应。临床样品qPCR检测阳性率为36.92%,高于PCR检测阳性率(26.15%),阳性符合率为100%。基于PRRSV ORF7基因构建的Taq Man荧光定量PCR检测方法线性关系良好、灵敏度高、重复性好、特异性强,可快速、高效检测临床样品PRRSV,为PRRSV早期诊断、及时防控和流行病学调查提供了科学的技术支撑。

摘要：为提高马铃薯蛋白资源的综合利用及其生物制品附加值,采用双酶法(木瓜蛋白酶和胰蛋白酶)水解马铃薯蛋白,以水解度DH(%)为指标,采用单因素实验设计,研究双酶比例、酶解温度、p H值和酶添加量对酶水解效果的影响;采用响应面法优化酶水解条件,并通过DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力测定水解产物的抗氧化性能。结果表明,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶在1∶2的复合比例下的酶水解效果最好,马铃薯蛋白双酶水解的最佳条件为:酶解温度49.39℃,水解pH 7.65,酶用量4000 U/g,在此条件下,水解度可达44.19%。水解物对DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基清除能力和Fe2+螯合能力分别为67.000%、69.750%、79.250%和79.000%。木瓜蛋白酶与胰蛋白酶结合能够有效水解马铃薯蛋白,为进一步制备马铃薯蛋白生物活性肽提供理论基础。

摘要：【目的】利用原核表达系统体外表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)NS5A基因,获得非结构蛋白NS5A,对其进行核苷酸、氨基酸序列分析,以解析BVDV非结构蛋白NS5A的功能。【方法】参考BVDV-1型毒株V006的NS5A基因序列(GenBank登录号:KX170647)设计并合成1对特异性引物,以分离到的牦牛BVDV GSTZ毒株cDNA为模板,PCR扩增NS5A基因片段,并克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组原核表达载体pET28a-NS5A。经酶切初步鉴定及测序鉴定正确后,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,然后利用IPTG诱导表达。经10%SDS-PAGE电泳及Western blotting分析鉴定重组蛋白的表达,并根据NS5A基因的序列构建遗传发育进化树,利用DNAStar软件预测NS5A蛋白的亲水性、表面可塑性和抗原性等特性,并结合二级结构的预测对NS5A蛋白的B细胞抗原表位进行预测。【结果】PCR扩增NS5A目的基因片段为1488 bp,双酶切和测序鉴定结果证明,重组质粒pET28a-NS5A构建成功。经10%SDS-PAGE电泳及Western blotting鉴定重组蛋白,表达出了大小为55 ku的目的蛋白,大小与预期结果相符。通过对不同BVDV毒株NS5A基因序列构建遗传发育进化树,显示GSTZ毒株NS5A在遗传进化特征上属于BVDV-1型。NS5A蛋白的亲水性主要位于12—21、32—69、75—113、120—135、143—147、152—163、165—180、215—230、265—274、296—340、348—378、389—447、455—463、469—495位氨基酸处,表面可塑性主要位于14—18、37—42、76—81、86—109、154—160、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373、414—442、430—437、454—460位氨基酸处,柔性区域较多,主要位于14—21、37—43、67—82、86—93、97—110、152—158、169—179、218—231、240—255、296—310、313—328、344—359、364—373、413—422和472—483位氨基酸处。NS5A蛋白的B细胞抗原表位主要位于15—18、76—81、154—158、169—178、218—228、297—309、348—358、365—373和414—422位氨基酸处。【结论】成功表达并鉴定了牦牛源BVDV的非结构蛋白NS5A,系统发育进化树表明BVDV GSTZ株基因型属于BVDV-1型,NS5A蛋白具有良好的抗原性,为深入解析BVDV非结构蛋白NS5A的自身结构功能、免疫学特性以及进一步研究非结构蛋白对病毒复制的影响提供参考。