摘要：目的设计、构建并筛选出转染至人骨肉瘤细胞系OS-9901,对c-myc沉默效果最佳的复制缺陷型重组腺病毒质粒pAd-c-myc-短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)包装出表达c-myc-shRNA的重组腺病毒,并测定其滴度。方法设计有shRNA结构的3对单链寡核苷酸(ssoligos),经变性退火为双链寡核苷酸(dsoligos),插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后,经LipofectamineTM2000阳离子脂质体介导入人骨肉瘤细胞系OS-9901,采用RT-PCR筛选对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子。采用293A细胞包装出表达c-myc-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒,观察其细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),采用病毒颗粒法(viral particles,VP)和50%组织培养感染剂量法(50%tissue culture infective dose,TCID50)测定病毒滴度。结果电泳验证后的dsoligos插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序结果提示构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确。从3对dsoligos通过RT-PCR方法筛选出对c-myc沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经PacⅠ酶切线性化后同源重组成功构建了介导c-myc-shRNA复制缺陷型重组腺病毒,CPE和空泡现象3d开始出现,6d更加明显。采用VP法测定的第1代腺病毒滴度为5.23×109VP/mL,经3～4代扩增后可达2.26×1012VP/mL。TCID50证实病毒滴度为10-3.8/0.1mL。结论通过RNA干扰技术,体外成功构建了介导shRNA-c-myc复制缺陷型重组腺病毒。

摘要：目的:构建并鉴定靶向人神经菌毛素-1(NRP-1)基因的小发卡RNA的慢病毒载体。方法:针对NRP-1mRNA设计了4条shRNA,并构建pGCSIL-RFP-shNRP1慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-RFP-shNRP1、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有NRP-1过表达载体共转染293T细胞,Western blot法检测Flag表达,观察NRP-1蛋白相对表达抑制效果。结果:PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达1×109Tu/mL。转染细胞中NRP-1蛋白相对表达显著降低。结论:成功构建了高效率的人NRP-1基因shRNA慢病毒载体。

摘要：目的构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响。方法利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序,并稳定转染至HT-29细胞。结果测序证明人C-erbB2siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Westernblot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达。结论成功构建了人CerbB2干扰载体质粒pGenesil-erbB,稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋白的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础。

摘要：目的了解西安地区帕金森病（PD）患者药物治疗情况。方法随机抽取西安地区6家综合医院，采用竞争入组法收集研究期间各医院门诊就诊的PD患者，进行面对面问卷调查。结果共人组PD患者92例，其中男48例，女44例；年龄43—86岁（65．6岁±17．1岁），病程0．2—27．8年（4．4年±9．4年）。不同首发症状患者间首选药物的差异无统计学意义（P〉0．05）。发病年龄〈65岁且认知功能正常者45例；发病年龄≥65岁且伴／或不伴有痴呆者47例，两组首选药物的差异无统计学意义（P〉0．05）。不同严重程度PD患者调查时用药方案的差异无统计学意义（P〉0．05）。55．3％的患者治疗中随意调整PD治疗药物，调整用药与患者性别、年龄、受教育水平、痴呆、家庭人口数、病程、Hoehn＆Yahr分级、每日服药次数、服药种类等无明显关系。结论西安地区PD治疗不规范，且很少使用多巴胺受体激动剂，半数以上患者随意调整治疗药物。

摘要：参照人体松质骨及皮质骨内管道的解剖结构,设计多孔预置血管管道新型的早期股骨头坏死修复植入体模型,并利用计算机辅助设计(CAD)建模模拟外科植入过程。通过陶瓷激光光固化技术,直接生成-βTCP陶瓷胚体,并通过烧结等一系列的工艺流程,成型制造出特定形态与微结构的骨生物多孔预置管道植入体。制成试件无碎裂、变形,内部微结构清晰,尺寸与结构与设计模型基本保持一致。孔径等相关参数可满足细胞生长需求。X线衍射分析显示制造过程中无相变及化学反应发生,不影响-βTCP生物性能。试件抗压强度达到23.54 MPa,与松质骨类似。该植入体可以体外复合细胞及生长因子,有望实现早期血管植入,快速建立循环系统及活化的骨坏死区,并可以早期提供足够力学支撑,符合理想骨移植替代物需求,具有广阔的临床应用前景。

摘要：目的观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用。方法用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响。结果检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU1453种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低。转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P<0.05)。结论不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力。

摘要：目的:设计并构建CDK1-shRNA质粒表达载体,转染肝癌HepG2细胞,验证shRNA对肝癌HepG2细胞CDK1基因的沉默效应,便于进一步研究CDK1的功能。方法:设计针对CDK1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的 pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体片段进行连接、转化。经测序等方法鉴定重组克隆。将重组载体质粒经脂质体包裹转染肝癌HepG2细胞,realtime PCR及Western blot检测RNA干扰效果。结果:重组克隆经测序证实插入的序列正确,realtime PCR及Western blot检测证实设计的3条RNA干扰序列有效沉默了肝癌HepG2细胞中的内源性CDK1。结论:所制备的CDK1-shRNA在肝癌HepG2细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CDK1为靶向的shRNA能够有效下调CDK1基因的表达,对周期依赖激酶CDK1功能的研究奠定基础。

摘要：目的探索视网膜缺血再灌注损伤后视网膜神经节细胞pax6的表达变化及意义。设计实验研究。研究对象缺血再灌注损伤大鼠视网膜。方法成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只,随机选取5只作为空白对照组,其余25只为视网膜缺血再灌注损伤组,采用升高右眼眼压的方法制作视网膜缺血再灌注损伤模型。视网膜缺血再灌注后1、2、4、6、8周分5组,每组5只,不同时间点取右眼行免疫荧光染色,观察视网膜神经节细胞中pax6表达情况。主要指标pax6的表达。结果视网膜缺血再灌注损伤后随着时间推移视网膜各层逐渐出现pax6表达阳性的细胞,对照组视网膜神经节细胞pax6表达阳性率为(1.28±1.41)%,损伤后1、2、4、6、8周分别为(0.99±1.23)%、(14.45±2.72)%、(50.88±4.73)%、(71.00±4.72)%、(78.80±4.62)%(F=1.350,P<0.0001)。各组与对照组两两比较,缺血后1周视网膜神经节细胞pax6表达阳性率差异无统计学意义(P=0.835),缺血再灌注损伤2、4、6、8周视网膜神经节细胞pax6表达阳性率均明显升高(P均<0.0001)。结论视网膜缺血再灌注损伤后视网膜各层均出现pax6表达阳性细胞,视网膜缺血再灌注损伤能诱导视网膜内源性干细胞激活。

摘要：目的:构建特异性shRNA腺病毒载体,使之干扰神经轴突过度生长因子(PTN)在胰腺癌细胞中的表达,探讨其对SD大鼠背根神经节神经元(DRGn)神经轴突的影响。方法:设计并合成4对靶向PTN单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导转染胰腺癌细胞,通过RT-PCR方法筛选对PTN沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒进行同源重组,筛选出正确重组子,用HEK293A细胞包装出表达shRNA-PTN的重组腺病毒并测定其病毒滴度,通过Western blot方法对腺病毒沉默PTN效果予以检测。shRNA-PTN腺病毒构建成功后感染胰腺癌PC-2细胞,然后和DRGn共培养,观察DRGn生长分化和形态特征。结果:测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从4对ds oligos筛选出对PTN沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-PTN复制缺陷型重组腺病毒。转染胰腺癌细胞后,Western blot检测显示shRNA-PTN腺病毒感染胰腺癌细胞后对PTN蛋白的沉默效果7 d后达最佳效果。感染shRNA-PTN腺病毒的胰腺癌PC-2细胞和DRGn共培养,DRGn神经轴突的生长和延长受抑制,以第7天最为明显。结论:成功地构建介导shRNA-PTN复制缺陷型重组腺病毒;感染shRNA-PTN腺病毒的胰腺癌PC-2细胞和SD鼠DRGn共培养可以抑制DRGn神经轴突的生长。

摘要：目的构建复制缺陷型重组腺病毒介导短发夹RNA(shRNA)干扰组织因子(TF)在胰岛表达。方法设计并合成四对单链寡核苷酸(ss oligo),经变性退火为双链寡核苷酸(ds oligo)插入穿梭质粒pENTR/U6载体,测序正确后经脂质体介导入成人胰岛,通过实时定量RT-PCR方法筛选对TF沉默效果最佳穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,然后与腺病毒骨架质粒行同源重组,筛选出正确重组子,用293A细胞包装出表达TF-shRNA的复制缺陷型重组腺病毒并测定其病毒滴度,通过实时定量RT-PCR腺病毒沉默TF效果予以检测。结果测序结果提示所构建的pENTR/U6-shRNA质粒正确,并从四对dsoligos筛选出对组织因子沉默效果最佳的穿梭质粒pENTR/U6-shRNA,经同源重组后成功构建了介导shRNA-TF复制缺陷型重组腺病毒。转染胰岛后,通过实时定量RT-PCR方法检测发现shRNA-TF腺病毒感染胰岛后对TF mRNA的沉默效果4d后达最佳效果,为54.29%(P<0.05vsNC)。结论成功构建的介导shRNA复制缺陷型重组腺病毒可以体外抑制胰岛细胞中组织因子的表达。