摘要：目的观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用。方法用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响。结果检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU1453种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低。转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P<0.05)。结论不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力。

摘要：目的:构建EGFRvIII与HBcAg重组基因的原核表达质粒,进行原核表达、纯化,观察表达蛋白的免疫原性和抗原性。方法:通过双酶切从pGEM-TEasy/PEP-3载体获得编码EGFRvIII突变区的cDNA片段,插入去除了主要免疫优势区的重组质粒pGEMEX/HBcAg中,获得重组质粒pGEMEX/c-PEP-3-c,将重组基因亚克隆于原核表达载体pET28a(+)中,通过IPTG诱导蛋白表达,利用Ni2+-NTA亲和层析法对融合蛋白进行纯化;用融合蛋白常规免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA检测小鼠血清中抗体的滴度。结果:经酶切鉴定、序列测定证实融合基因已插入pET28a(+)载体中,融合基因序列与设计序列完全一致。原核表达后表达量占沉淀全菌蛋白的56%,纯化产物占总蛋白的92%,浓度约8g/L。BALB/c小鼠经4次免疫后,其血清中中和抗体的滴度可达1∶16000,第6次免疫后血清中中和抗体的滴度达到1∶2.56×105,抗PEP-3抗体滴度达到1∶1.28×105,抗HBcAg抗体滴度小于1∶4×103。结论:融合基因PEP-3-HBcAg在大肠杆菌中可获得高效表达,表达的融合蛋白可以诱导小鼠产生高滴度和高特异性中和抗体,从而为高表达EGFRvIII恶性肿瘤基因工程疫苗的研究奠定基础。

摘要：目的:利用功能磁共振成像技术(fMRI),分别在施加色氨酸耗竭氨基酸混合物(TRP-)和配平氨基酸混合物(BAL)前后,对健康志愿者施加痛性电刺激,观察健康志愿者应用TRP-或BAL前后SⅠ区及SⅡ区的激活情况差异,探讨脑内5-羟色胺(5-HT)在SⅠ及SⅡ区中的分布情况及其在痛觉调控中的作用。方法:实验采用两阶段交叉设计。TRP-和BAL配方参照经典的Young氏方法。右利手健康志愿者6名,分别于服用TRP-和BAL前后施加1倍痛阈(服药前痛阈)电刺激,同期进行全脑fMRI扫描,应用功能性神经图像分析(AFNI)软件包进行后处理,以显示服用TRP-或BAL前后SⅠ及SⅡ区的激活差异。使用SPSS14.0统计软件对结果进行统计分析。结果:(1)服用TRP-前后,双侧SⅠ区、SⅡ区均出现激活,其激活体积在服用TRP-前后具有明显差异(P0.05);(3)服用TRP-前后,志愿者1倍痛阈具有明显差异(P0.05)。结论:在中枢神经系统中,5-HT起着重要的镇痛作用。服用TRP-后引起急性色氨酸耗竭(ATD),可以降低脑内5-HT水平,引起志愿者痛阈降低。应用TRP-前后,SⅠ区,SⅡ区激活体积具有明显差异(P<0.05),提示这些脑区不仅参与痛觉调控,而且可能直接参与5-HT对痛觉的镇痛作用。

摘要：目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。