摘要：目的构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响。方法利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序,并稳定转染至HT-29细胞。结果测序证明人C-erbB2siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Westernblot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达。结论成功构建了人CerbB2干扰载体质粒pGenesil-erbB,稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋白的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础。

摘要：目的:设计并构建CDK1-shRNA质粒表达载体,转染肝癌HepG2细胞,验证shRNA对肝癌HepG2细胞CDK1基因的沉默效应,便于进一步研究CDK1的功能。方法:设计针对CDK1mRNA靶序列的小发夹状RNA,化学合成含茎环结构的正义链与反义链,退火形成带内切酶粘/平末端的双链后,与酶切后的 pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体片段进行连接、转化。经测序等方法鉴定重组克隆。将重组载体质粒经脂质体包裹转染肝癌HepG2细胞,realtime PCR及Western blot检测RNA干扰效果。结果:重组克隆经测序证实插入的序列正确,realtime PCR及Western blot检测证实设计的3条RNA干扰序列有效沉默了肝癌HepG2细胞中的内源性CDK1。结论:所制备的CDK1-shRNA在肝癌HepG2细胞中可获得高效转染,并能产生特异性的基因沉默效应,以CDK1为靶向的shRNA能够有效下调CDK1基因的表达,对周期依赖激酶CDK1功能的研究奠定基础。

摘要：目的观察RNA干扰技术沉默Smad4基因表达对人前列腺癌细胞增殖能力的影响,探讨Smad4在前列腺癌恶性进展中的作用。方法用半定量RT-PCR和Western blot方法检测LNCaP、PC-3、DU145以及ARCaP亚细胞系IF11、IA8等多种不同前列腺癌细胞Smad4 mRNA及蛋白表达的情况,筛选出Smad4基因阳性表达的细胞;针对Smad4基因不同部位设计并化学合成3对不同的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),脂质体介导瞬时转染阳性表达Smad4的细胞,转染后48h分别用RT-PCR和Western blot检测Smad4 mRNA及蛋白表达水平的变化,用MTT法检测沉默Smad4表达对细胞增殖的影响。结果检测的5种前列腺癌细胞中仅LNCaP、PC-3、DU1453种细胞表达Smad4 mRNA及蛋白;选择PC-3细胞做siRNA转染,与阴性对照序列组(siRNA-NC)相比,转染48h后,转染SiRNA1、SiRNA2、SiRNA3的3组PC-3细胞的Smad4 mRNA表达水平均显著下降,但仅有siRNA3组Smad4蛋白表达水平显著降低。转染SiRNA3沉默Smad4基因表达后PC-3细胞的体外增殖能力显著增强(P<0.05)。结论不同前列腺癌细胞Smad4基因的表达存在差异,靶向siRNA下调Smad4的表达可增强前列腺癌细胞的增殖能力。

摘要：目的克隆出针对表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)PEP-3表位的cDNA片段,为高表达EGFRvⅢ肿瘤的免疫治疗奠定基础。方法根据PEP-3的碱基序列设计出有12对互补碱基的正负引物,正负引物互为模板进行PCR扩增,制备出两端含酶切位点的PEP-3 cDNA片段,再将扩增的PCR产物亚克隆于载体pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T Easy/PEP-3。结果经限制性内切酶酶切鉴定和DNA测序证实,编码PEP-3的cDNA片段被成功扩增并亚克隆于载体pGEM-T Easy中。结论成功克隆了编码表皮生长因子受体Ⅲ型突变体PEP-3表位的cDNA片段。

摘要：目的:构建Gαs慢病毒表达载体并检测其表达性能,以便应用过表达技术进一步研究Gαs功能。方法:设计针对人Gαs DNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的FUW载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆质粒,转染293T细胞。用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用QPCR、Western blot检测慢病毒系统过表达效果。结果:证实人Gαs正确插入慢病毒载体,人Gαs慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达Gαs。结论:人Gαs慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人Gαs慢病毒功能打下了基础。

摘要：目的:了解老年进展期癌症患者自杀意念的检出率及危险因素。方法:采用横断面研究设计,使用病人健康问卷-9、MD安德森症状问卷、医院焦虑抑郁量表(HADS)对全国10个中心的住院进展期癌症患者进行调查,样本为年龄65岁及以上的691例老年患者,使用logistic回归分析从人口统计学与疾病相关因素、症状负担和心理痛苦3个层面探索自杀意念的危险因素。结果:老年进展期癌症患者自杀意念的检出率为21.7%。焦虑(HADS-A得分≥8:OR=4.48,95%CI:2.60~7.71,P<0.001)、抑郁(HADS-D得分≥8:OR=2.50,95%CI:1.46~4.27,P<0.01)是自杀意念的危险因素。结论:焦虑、抑郁是老年进展期癌症患者自杀意念突出的危险因素,应重视对这一人群的焦虑抑郁的筛查。