摘要：目的:构建基于CRISPR Cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型隐球菌标准菌株及其他菌株(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌),提取其核酸,以评估方法的特异性及最低检测限。进一步收集临床确诊的10例肺部及10例中枢神经系统新型隐球菌感染患者的支气管肺泡灌洗液及脑脊液,以评估本研究构建的核酸诊断方法的临床检测性能。结果:共设计6组引物及crRNA组合,经筛选得到1组最佳组合。本研究构建的检测方法特异性高(与7种其他类型菌株无交叉反应),最低检测限达到5 copies/μL,整个检测流程速度快(在1 h内完成)。针对10例支气管肺泡灌洗液及10例脑脊液临床标本的阳性检出率均为100%。结论:本研究构建的新型核酸检测方法,具有高度的特异性和良好的检测限,在临床标本检测中同样具有优良检测性能,具备了较强的临床新型隐球菌核酸检测的应用潜力。

摘要：目的建立适合富含GC区SNP分型的序列特异性PCR方法,分析子宫内膜癌特定ERα Exon3位点C729T多态性基因分型。方法选择22例子宫内膜癌患者与42例良性病患者为研究对象。建立富含GC区序列特异性PCR(SS-PCR)。将两对引物分别进行PCR扩增,所设计的两条特异性引物即内引物分别与DNA 双链的两条单链相同,其3′端正好与SNP位点重合,由引物的3′端控制着引物的延伸反应,根据延伸产物的条带确定SNP类型;并通过在引物的3′端区域倒数第3位引入一个人为不匹配碱基来提高延伸反应的特异性。应用该方法鉴别Exon3 SNP位点C729T基因型,并通过直接测序法验证。结果建立的序列特异性PCR方法适合富含GC区SNP分型,能够准确分析子宫内膜癌的特定ERα Exon3位点C729T多态性基因分型。结论富含GC区SNP分型的序列特异性PCR方法,可以用于子宫内膜癌的特定ERα Exon3位点C729T多态性基因分型。

摘要：目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)core对肝细胞的转分化作用,构建可以表达HCV core-Ant融合蛋白的原核表达载体.方法:已经构建的HCV core cDNA克隆质粒为模板,用PCR技术删除终止子,通过T载体克隆法构建pGEM-T-HCV core cDNA克隆质粒.经筛选阳性克隆、酶切鉴定并测序后,通过常规分子生物学亚克隆方法,利用已有的pGEMT-Ant载体,连接Ant和HCV core cDNA在同一ORF,插入到pTE28表达载体,建立了表达HCV core和果蝇穿膜肽Ant的融合蛋白表达克隆.使用IPTG诱导方法,从表达菌中提取包涵体蛋白,复性后使用ELISA方法检测表达蛋白的抗原性.使用HRP标记的抗HCV核心抗体免疫组织化学一步法检测HCV core和HCV core-Ant融合蛋白对NIH 3T3细胞的转导能力.结果:pGEM-T-HCV core-Ant cDNA克隆的酶切物理图谱及测序证实结果证实建立了果蝇穿膜肽Ant cDNA克隆和删除了终止子的HCV core cDNA克隆.亚克隆后建立的重组质粒pTE28HCV coreAnt经限制性内切酶后,琼脂糖凝胶电泳,结果显示酶切片段大小和设计预计值一致.序列测定结果表明HCV core cDNA和穿膜肽Ant cDNA处于同一ORF.通过转化BL21 DE3表达菌,IPTG诱导后,PAGE电泳成功表达了HCV core-Ant蛋白.复性后包被酶标板,间接ELISA方法检测抗HCV抗体阳性血清和正常人血清证实表达蛋白具有敏感和特异的抗原性.目标蛋白能转导进入NIH 3T3细胞显示了大量的阳性着色细胞.这些阳性着色细胞的着色颗粒主要存在细胞质中.表明构建表达HCV core-Ant融合蛋白的pET28原核表达载体成功.结论:通过分子克隆体外重组技术成功建立了表达HCV core-Ant的pTE28原核表达载体,为研究HCV core对细胞的转分化作用和HCV的致癌机制奠定了基础.

摘要：目的 建立一种用于肝癌早期诊断和监测的血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法。方法 采用Trizol法提取肝癌患者血清中总RNA,以肝癌发生具有代表性的miRNA-125a基因为检测序列,分别设计逆转录引物、扩增引物和Taqman探针; 构建和制备miRNA-125a重组质粒标准品,建立血清miRNA-125a Taqman 实时荧光定量PCR检测方法。结果 成功构建了miRNA-125a重组质粒载体,制备了miRNA-125a重组质粒标准品,建立了血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR扩增体系。经实验验证,所设计引物具有较好的特异性,引物的最低检测限为78.125 copies/μl; 对17例肝癌患者血清miRNA-125a的检测结果在（1.45×10^2-3.52×10^5）copies/μl之间。结论 血清miRNA-125a Taqman实时荧光定量PCR检测方法的建立,为原发性肝癌早期诊断和监测提供一种新的分子诊断定量方法。

摘要：目的探索建立一种可快速鉴定儿童血流感染常见病原菌的多重PCR体系。方法通过16S r DNA-PCR筛选出7种引起血流感染的常见病原菌,并针对这些病原菌设计特异性引物组合成多重PCR系统,检测该系统的特异性和敏感性;将该体系的检测结果与血培养及16S r DNA-PCR比较。结果该体系可以扩增出7种病原菌的特异性基因片段,病原菌检出率高于血培养且与16S r DNA-PCR差异无统计学意义,敏感性和特异性良好。结论本研究建立的多重PCR方法可快速、准确地鉴定引起儿童血流感染的常见病原菌,可作为快速检测方法在临床实验室中应用。

摘要：目的分析16S rRNA通用引物PCR检测方法及临床常规细菌培养方法检测疑似自发性细菌性腹膜炎患者腹水标本中潜在病原菌的病原学特点,并以此为基础建立一套适用于临床的可检测常见菌株的特异性引物多重PCR体系。方法首先采用16S rRNA通用引物PCR检测方法,检测并分析113份疑似自发性细菌性腹膜炎患者腹水标本中潜在的病原学感染及特点。其次,统计同期送检腹水培养标本的检测结果。在上述研究和数据统计的基础上建立适用于临床的可检测腹水常见菌株的特异性引物多重PCR体系,并测试其检测灵敏度及特异性。结果 113份腹水标本16S rRNA通用引物PCR检测的阳性率为33.6%,其中检出的病原菌为大肠埃希菌(39.47%)、肠球菌(21.05%)、葡萄球菌属(18.42%)、鲍曼不动杆菌(10.53%)、肺炎克雷伯菌(5.26%)、阴沟肠杆菌(5.26%)。2013年及2014年腹水培养的阳性率分别为16.1%和14.3%,显著低于上述16S rRNA PCR检测法(P<0.01),且检出的细菌种类大致相同。针对16S rRNA通用引物PCR和腹水培养两种检测方法检出的致病菌进行特异性引物设计及反应体系优化,建立多重PCR体系,可快速准确检出腹水标本中的常见菌种。结论 16S rRNA通用引物PCR方法用于腹水常见致病菌检测具有较好的检出率,可用于临床自发性细菌性腹膜炎的快速诊断。本研究初步建立的腹水常见致病菌检测特异性引物多重PCR体系具有一定的临床应用价值。

摘要：目的 建立基于DHBV病毒正、负链缺口区设计引物、沉淀蛋白结合的DNA、酶切消化残留线性DNA的DHBVcccDNA荧光定量PCR方法.方法 根据DHBV cccDNA和rcDNA结构的不同,将引物设计在DHBV DNA负链缺口的两侧.采用十二烷基硫酸钾蛋白质沉淀法分离肝组织中cccDNA和rcDNA.并对提取的DNA进行紫外定量,按照每2UPSAD消化500ng cccDNA,计算PSAD的用量,酶切消化残存的线性DNA.以pBR322/2DHBV Core重组质粒为PCR标准品,通过优化反应体系和扩增条件,建立检测DHBV cccDNA的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,并进行方法学考察和实际应用.结果 优化的PCR扩增产物电泳后可见239 bp的DNA片段,与目标片段长度相同.标准曲线回归方程Y=-4.085 7X＋48.805,R2=-0.997 6.方法的灵敏度为103 copies/ml,线性范围可达103～108 copies/ml.方法特异性强,未检出DHV,HBV及E coli DNA.对已感染DHBV的鸭肝组织检测DHBV cccDNA,进行定量,含量从0.36～1733.08 copies/diploid genome.其中分布最广的是10～99 copies/dioploid *** cccDNA占总DHBV DNA的比例平均仅为3.86％,范围从0.01％～13.3s％.结论 根据DHBV cccDNA与rcDNA的结构和理化性质的差异,设计能够特异性扩增DHBV cccDNA的荧光定量PCR方法,方法灵敏度高、特异度强,可广泛应用于DHBV和HBV抗病毒治疗策略的相关研究中.

摘要：目的:探讨高压电烧伤对SD大鼠外周血血栓调节蛋白(thronlbonlodulin,TM)、蛋白C(protein C,PC)、蛋白S(protein S,PS)及D二聚体(D-Dimer,D-D)的影响。方法:将120只SD大鼠按随机数字表法分为假高压电烧伤组(简称假伤组)、高压电烧伤组(简称电伤组),每组60只。2组致伤前15 min按随机数字表法各取10只大鼠,心脏采血分离血浆。电伤组余下50只大鼠用调压器和实验变压器造成高压电烧伤,假伤组余下50只大鼠按相同装置不通电模拟致伤。伤后5 min和1、2、4、8 h,每组SD大鼠按随机数字表法各取10只大鼠,心脏采血分离血浆。测定各时相点血清中TM、PC、PS及血浆中D-D的变化。对数据行析因设计方差分析、LSD检验。结果:电伤组SD大鼠的TM浓度在伤后5 min至8 h明显高于假伤组(均P0.05)外,电伤组大鼠其余各时相点PC、PS浓度均低于假伤组(均P<0.05):D-D浓度在伤后8 h达到最高值[(173.05±4.08)ng/mL]。结论:高压电烧伤早期,SD大鼠TM、D-D的浓度升高,PC、PS的浓度降低,血管内皮细胞的完整性被破坏,凝血功能受到严重影响。

摘要：目的研究α-甘露聚糖肽作为乳腺癌多肽疫苗E75佐剂的免疫效果,探索其作为基于细胞免疫的多肽类肿瘤疫苗佐剂的可行性。方法将51只C57BL/6-Tg(HLA-A2.1) 1Enge/J雌性转基因小鼠随机分为6组。佐剂疫苗组佐剂剂量采用对数等距设计,固定抗原E75用量,标记为E75+30μg PA组,E75+100μg PA组,E75+300μg PA组,E75+1 000μg PA组;同时设置E75单独免疫组与空白对照组。所有小鼠共免疫3次,每隔7 d进行皮下两点接种。首次免疫后,评估局部刺激反应及急性毒性反应。记录各次免疫后小鼠体质量变化。末次免疫14 d后,检测各组小鼠E75肽特异性脾淋巴细胞刺激指数、细胞因子IFN-γ水平及淋巴细胞亚群比例,并分析各组间差异。结果所有组小鼠局部刺激反应评分均为0分,佐剂疫苗组小鼠主要脏器无病理改变。佐剂疫苗组及E75单独免疫组小鼠平均体质量与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。E75单独疫苗组与空白对照组相比,脾细胞未见明显增殖效应,IFN-γ含量及CD4^+、CD8^+T细胞比例无显著差异(P>0.05)。与E75单独疫苗组相比,脾细胞增殖效应、IFN-γ水平及CD4^+、CD8^+T细胞比例在E75+30μg PA组与E75+100μg PA组升高(P<0.05),在E75+300μg PA组和E75+1 000μg PA组下降(P<0.05)。结论α-甘露聚糖肽作为佐剂能够在转基因小鼠模型上提高E75乳腺癌疫苗的免疫效应,具有增强基于细胞免疫的多肽类肿瘤疫苗免疫原性的能力。

摘要：目的研究不动杆菌产超广谱β-内酰胺酶的检测方法,分析其与抗生素耐药的关系。方法采用NCCLS(美国临床标准委员会)推荐方法对收集120株不动杆菌进行产ESBLs(超广谱β-内酰胺酶)的筛选和确认实验,按照PCR基因分型原则采用碱裂解法提取质粒DNA,以此为模版设计引物和反应条件,用PCR法对产ESBLs株进行基因分型.结果产ESBLs共检出20株,检出率占16.7%.产酶株耐药率明显高于非产酶株。PCR进行ESBLs基因分型,检出TEM型12株,SHV型4株,PER型4株,未检出OXA.结论西安市不动杆菌产ESBLs株基因型以TEM为主,产ESBLs可能是西安市不动杆菌耐药的主要机制。