摘要：本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

摘要：已有研究发现发育调节脑蛋白(Drebrin)参与细胞间信息通讯、神经传递、肿瘤转移、精子发生等生命活动,但其对病毒的作用研究却很少。为研究Drebrin对猪流行性腹泻病毒(PEDV)增殖的影响,本研究根据GenBank登录的非洲绿猴Drebrin基因序列(XM_008015438.2)设计引物,经PCR从Vero细胞中扩增得到Drebrin基因,经测序后构建系统进化树分析其遗传进化关系。结果显示,Vero细胞Drebrin基因编码区(CDS)长2088 bp,编码695个氨基酸,且该基因相对保守,与其他物种Drebrin基因的同源性均较高。利用扩增的Drebrin基因构建真核表达载体pcDNA3.1-Drebrin-Flag,并以不同浓度转染Vero细胞后感染PEDV,利用RT-qPCR检测Vero细胞中PEDV mRNA的转录水平,采用western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测细胞中PEDV N蛋白的表达量,采用TCID50检测病毒滴度。结果显示,Vero细胞中过表达的Drebrin可显著抑制细胞内PEDV mRNA水平(P<0.01)和N蛋白表达量,降低细胞外病毒滴度,具有抑制PEDV增殖的作用,且抑制效率与转染质粒的浓度呈正相关。进一步利用激光共聚焦技术检测Drebrin与PEDV S蛋白的亚细胞定位,结果显示,Drebrin与S蛋白在细胞质中存在共定位现象,提示两种蛋白可能存在互作。本研究首次证明Drebrin对PEDV在Vero细胞中的增殖有抑制作用,为Drebrin的功能研究提供实验基础,也为抗PEDV机制相关研究提供参考。

摘要：【目的】试验旨在建立大量表达及纯化猪δ5干扰素(pIFN-δ5)的方法,并对其抗猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)感染的作用进行分析。【方法】根据GenBank中pIFN-δ5序列(登录号:NM_001164854.1)设计引物,以猪肝脏组织cDNA为模板进行PCR扩增;将目的基因连接入经EcoRⅤ和HindⅢ双酶切的线性化pET-32a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,优化诱导表达条件,并进行SDS-PAGE和Western blotting检测;pIFN-δ5蛋白大量表达后使用镍离子亲和层析柱纯化,并测定蛋白纯度;采用细胞病变抑制法检测pIFN-δ5的干扰素效价,采用CCK8方法检测pIFN-δ5的细胞毒性,进一步测定其抗PEDV的感染能力。【结果】试验成功构建了重组表达质粒pET-pIFNδ5,经诱导条件摸索发现,在D值为0.5~0.6、IPTG浓度为0.8 mmol/L、37℃诱导条件下,目的蛋白pIFN-δ5主要表达于菌体裂解上清中;经大量表达并纯化后可获得纯度>95%的pIFN-δ5蛋白。使用VSV/MDCK细胞滴定系统检测pIFN-δ5的比活性为5×10^(4)U/mg;CCK8检测表明pIFN-δ5的细胞毒性较小。实时荧光定量PCR、Western blotting和间接免疫荧光检测结果表明,pIFN-δ5具有显著抗PEDV感染能力。【结论】本试验建立了表达和纯化pIFN-δ5的方法,通过一系列的体外抗病毒试验证实pIFN-δ5具有良好的抗PEDV感染的活性,为将pIFN-δ5作为抗病毒药物及临床应用奠定了基础。

摘要：为建立一种检测猪圆环病毒2型多重实时荧光定量PCR方法,可对3种基因型PCV2a、PCV2b、PCV2d检出并分型。针对3种基因型ORF2基因,在保守序列设计通用引物并分别设计特异Taq Man探针,3条探针分别标记NED、JOE和FAM荧光报告基团,建立多重实时荧光定量PCR反应体系,检测其灵敏性、重复性和特异性。经条件优化多重荧光定量PCR的反应体系为30μL,各型探针加样为0.6μL,退火温度为60℃;最低检测值为PCV2a 100 copies/μL、PCV2b 57 copies/μL和PCV2d 100 copies/μL,而且该方法对猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等其他6种猪源主要病毒核酸检测均为阴性,具有良好的特异性;组内和组间的检测变异系数均小于等于3.6%;通过检测218份阳性样本,结果表明该方法能快速检测猪圆环病毒2型三种主要流行型并同时分型,为PCV2快速分型的诊断提供新方法。

摘要：为快速同时检测牛星状病毒(BAstV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),本研究针对BAstV基因组ORF1a基因、BVDV基因组多聚蛋白基因和IBRV基因组g B基因的保守区域各设计特异性引物和探针,经反应体系和扩增程序优化,建立了BAstV、BVDV和IBRV三重荧光PCR检测方法,对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并应用该方法对临床样品进行检测。结果显示,该方法可扩增BAstV、BVDV和IBRV的核酸,不能对多杀性巴氏杆菌(Pm)、B型牛鼻炎病毒(BRBV)、口蹄疫病毒(FMDV)等病原的核酸进行扩增,特异性较强;对BAstV、BVDV和IBRV的最低检测限(LOD)均为305copies/μL,敏感性较高;检测BAstV、BVDV和IBRV的组内、组间重复性试验变异系数(CV)值均小于3%,重复性较好。应用该方法检测100份临床样品,BAstV、BVDV、IBRV的阳性检出率分别为0、11%、6%。本研究建立的三重荧光PCR方法具有敏感性高、特异性强、在同一反应体系中可以快速鉴别检测BAstV、BVDV、IBRV等优点,可应用于临床BAstV、BVDV、IBRV感染的检测。

摘要：猪萨佩罗病毒（porcine sapelovirus,PSV）是一种无囊膜、球形的单股正链RNA病毒,属于微RNA病毒科,能引起猪脑脊髓灰质炎、肠道、呼吸道、生殖器官疾病等多系统综合征。本试验依照已经在NCBI发表的中国地区猪萨佩罗病毒基因序列设计合成了1对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速高效检测PSV的RT-PCR方法。结果表明,建立的RT-PCR检测方法特异性高、敏感性好,对PSV的最低检测限为4×103拷贝/μL;利用优化后的RT-PCR方法对2014~2016年间我国7个省市的345份临床样品进行检测,结果显示,临床PSV感染的感染率为8.12%（28/345）,表明我国猪场中存在PSV感染。

摘要：为深入研究猪轮状病毒VP8蛋白的结构和功能,以及研制新型猪轮状病毒疫苗,利用生物信息学软件DNAStar对本研究室保存的1株A组G9P7型猪轮状病毒NJ2012的VP8基因序列进行核苷酸和氨基酸同源性分析;设计并合成1对引物,采用RT-PCR方法扩增VP8蛋白编码基因,用限制性核酸内切酶对目的片段与pET28a(+)原核表达载体进行双酶切,构建了重组原核表达载体,用IPTG诱导表达,并进行Western blot验证。结果显示:NJ2012毒株的VP8基因序列与参考毒株序列的核苷酸同源性为53.9%~99.2%,氨基酸同源性为42.1%~97.5%;VP8基因克隆成功,经测序与目的基因完全一致;经鉴定,构建的重组原核表达质粒pET28a-VP8能够在DE3宿主菌中表达,该蛋白以包涵体形式存在;Western blot结果显示该蛋白可与抗His-tag鼠单克隆抗体发生特异性反应。本研究实现了VP8蛋白在原核系统中稳定表达,为调查该蛋白的免疫原性及研制安全、高效的猪轮状病毒亚单位疫苗提供了参考。

摘要：为加强塞内卡病毒(SVA)在不同宿主的诊断及流行病学监测与防控,根据GenBank中发表的SVA VP1基因区域设计一对特异性引物和带有TaqMan发光基团标记的探针,构建重组阳性质粒并用作建立实时荧光定量RT-PCR方法的模板,对反应体系和条件进行优化,构建标准曲线并验证该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示,该方法的最适退火温度为55℃,最佳引物和探针浓度分别为0.2μmol/L和0.4μmol/L,最佳反应循环数为45,Ct值与标准品浓度的对数线性关系好。对猪源、鼠源及牛源SVA和其他动物病毒(O型口蹄疫病毒、水疱性口炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒、边界病毒、猪库布病毒、牛库布病毒、山羊鼻内肿瘤病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛结节性皮肤病病毒、牛冠状病毒、D型流感病毒、蓝舌病毒)的核酸检测结果显示,除猪源、鼠源及牛源SVA为阳性外,其他病毒核酸为阴性。该方法最低检测限为2.66×10~1拷贝/μL,重复试验中组内和组间变异系数均小于0.1%。建立的检测多宿主SVA TaqMan RT-qPCR方法具有良好的特异性和稳定性,为SVA在不同宿主间的疾病诊断与流行病学调查或监控提供了快捷的方法。

摘要：为了生产出硒量较高的牦牛源鼠李糖乳杆菌,采用含不同浓度亚硒酸钠的液体培养基、不同培养温度、不同加硒时间设计培养方案。结果表明,最佳培养条件是培养温度38℃、亚硒酸钠浓度12μg/mL、加硒时间第6 h,培养24 h,转化率为50.34%、富硒量高达5658.256μg/g。本研究为生产富硒乳酸菌产品提供了较好的依据。

摘要：探索Cu^(2+)胁迫对西藏林芝市巴宜区毛果胡卢巴(Trigonella pubescens)种子萌发的影响,为西藏矿区周边Cu^(2+)污染土壤植被修复提供依据。以毛果胡卢巴种子为材料,采用纸上发芽法,对其进行不同浓度的Cu^(2+)溶液(0,40,80,160,300,400,500 mg·L^(-1))处理,研究不同浓度Cu^(2+)溶液对毛果胡卢巴种子发芽率、发芽指数、活力指数以及根长和芽长的影响。结果表明,低浓度的Cu^(2+)处理有利于种子萌发,但不利于其种子活力指数和根芽的生长;毛果胡卢巴种子的发芽率和发芽指数均以40 mg·L^(-1)1Cu^(2+)溶液浓度为界呈先升后降的变化趋势;活力指数、幼苗的根长和芽长随Cu^(2+)溶液浓度的升高呈持续下降的趋势。毛果葫芦巴对Cu^(2+)的耐受性较差,在修复Cu^(2+)污染的土壤植被中不具有应用潜力。