摘要：目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的人Fox M1 sh RNA重组慢病毒载体,并构建筛选Fox M1敲低的人前列腺癌稳定细胞株,检测Fox M1的表达及对细胞增殖能力的影响。方法设计并合成3对特异性针对人Fox M1基因的sh RNA靶序列,构建到p HBLV-U6-Zs Green-Puro慢病毒载体中,测序鉴定载体构建情况,利用慢病毒三质粒系统转染包装293T细胞,荧光显微镜下观察转染效率。收集到的病毒上清转染人前列腺癌DU-145细胞,Real-time PCR检测各组细胞Fox M1 m RNA水平,经嘌呤霉素筛选建立Fox M1敲低稳定细胞株,用Western blotting法检测细胞中Fox M1表达,并用MTT法观察稳转细胞的生长增殖活性,流式细胞术观察稳转细胞凋亡情况,平板克隆实验观察稳转细胞的克隆形成能力。结果经测序鉴定成功构建了3对Fox M1sh RNA慢病毒载体,并进行包装,感染DU-145细胞后Real-time PCR检测结果表明第1对慢病毒载体干扰效率最佳,嘌呤霉素抗性筛选建立了Fox M1敲低稳定细胞株,荧光显微镜观察感染效率较高,Western blotting结果显示细胞中Fox M1蛋白表达明显受到抑制,细胞的生长增殖能力明显受限,流式细胞术结果显示Fox M1敲低组细胞凋亡率高于对照组,平板克隆实验结果表明Fox M1敲低组细胞克隆形成能力下降。结论本研究成功构建了Fox M1 sh RNA慢病毒载体,建立了Fox M1敲低稳定前列腺癌细胞株,抑制细胞内Fox M1的表达能够抑制前列腺癌细胞DU-145的生长增殖、克隆形成能力,并能诱导细胞凋亡。

摘要：背景:电磁脉冲是一种高能非电离辐射,它涵盖的频谱极宽,对电子仪器具有极强的破坏力,并具有一定的生物损伤效应。本课题组前期实验发现,电磁脉冲可造成实验大鼠学习记忆能力的显著下降,并且影响其海马长时程增强效应的形成。目的:观察电磁脉冲照射对大鼠海马组织中氨基酸类神经递质含量和N-甲基-D-天冬氨酸受体的影响。设计:随机对照的实验,方差分析。单位:军事医学科学院放射与辐射医学研究所。材料:实验于2004-01/03在军事医学科学院放射与辐射医学研究所完成。实验选用雄性Wistar大鼠32只,随机分为电磁脉冲组26只和对照组6只。方法:电磁脉冲组大鼠经电磁脉冲照射(6×104V/m,脉冲上升时间20ns,脉宽30μs,频率2.5脉冲/min,作用2min)后即刻,3,6,24,48h麻醉状态下断头取脑,剥离海马;用高效液相色谱法测定氨基酸含量,并以3H标记的谷氨酸为配基进行放射性配基-受体结合实验。对照组麻醉处死前不做任何处理。主要观察指标:①各组大鼠海马组织兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸含量的变化。②各组大鼠海马N-甲基-D-天冬氨酸受体的最大结合量和平衡解离常数的变化。结果:32只大鼠全部进入结果分析。①电磁脉冲照射后即刻、3h、6h可见天冬氨酸的含量显著升高[峰值(17.25±1.63)μmol/L],明显高于对照组[(10.56±1.5)μmol/L,P<0.05],谷氨酸含量也于上述3个时间点升高[峰值(13.67±0.95)μmol/L],显著高于对照组[(6.94±1.1)μmol/L,P<0.05],两者含量均于照射后24h渐趋恢复,48h接近正常水平。3种抑制性氨基酸(甘氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸)的含量也于电磁脉冲照射后不同时间点升高,并于48h恢复。谷氨酸/γ-氨基丁酸比值于照后即刻明显升高(P<0.05),照后24h明显下降,48h恢复至接近对照组。②电磁脉冲照射后即刻大鼠海马中N-甲基-D-天冬氨酸受体的平衡解离常数开始下降,照后3h下降最显著(P<0.05),6h渐有恢复,48h恢复至正常水平;受照大鼠海马中N-甲基-D-天冬氨酸受体的最大结合量于照后3h和6h显著下降(P<0.05),24h渐有恢复,照后48h明显升高,超过正常组水平(P<0.05)。结论:电磁脉冲照射导致大鼠海马组织中兴奋性氨基酸含量及谷氨酸/γ-氨基丁酸比值升高;同时N-甲基-D-天冬氨酸受体的亲和力升高及受体密度下降。提示实验动物认知障碍可能与兴奋性氨基酸的过度释放和N-甲基-D-天冬氨酸受体功能改变有关。

摘要：目的：构建过表达母系表达印记基因MEG3（materally expressed gene 3,MEG3）全长的慢病毒载体,观察其对骨髓瘤细胞凋亡的影响。方法：以包含MEG3全长的包装质粒pcDNA3.0-MEG3为模板,设计针对MEG3全长的引物（寡核苷酸片段）,经PCR扩增后获得MEG3全长,并将其亚克隆入线性化的慢病毒表达载体pCDH-EF1-copGFP中,经双酶切、PCR及测序等方法鉴定。利用脂质体转染试剂将鉴定正确的pCDH-EF1-MEG3-copGFP重组质粒转染HEK-293T细胞,进一步通过荧光显微镜和流式细胞术检测GFP表达效率,real-time PCR检测MEG3mRNA表达水平。通过三质粒共转染及PEG纯化的方法获得慢病毒,以优化感染滴度感染骨髓瘤细胞系,通过流式细胞术检测过表达MEG3对细胞凋亡的影响。结果：经酶切、PCR及测序等方法证实成功构建pCDH-EF1-MEG3-copGFP过表达载体;通过流式细胞术测定制备的慢病毒滴度为1.86×10^8pfu/ml;流式细胞术检测和realtime PCR方法证实MEG3在293T细胞和骨髓瘤细胞中表达明显上调;流式细胞术检测证实过表达MEG3可诱导骨髓瘤细胞凋亡。结论：成功构建并制备过表达MEG3的慢病毒过表达载体pCDH-EF1-MEG3-copGFP,该载体能高效过表达MEG3并诱导骨髓瘤细胞凋亡,进一步证实了MEG3具有抑癌功能,为进一步研究MEG3调控骨髓瘤细胞生物学特性及机制奠定了基础。

摘要：目的针对大鼠信号转导子及转录激活子3(STAT3)基因序列,构建特异性短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体。方法根据STAT3基因序列及shRNA设计原则,设计4条干扰效果最佳的shRNA,化学合成4对引物,通过PCR扩增获得dsDNA模板,采用DNA重组技术与pGCsi-U6/Hygro/GFP空载体连接,转化DH5a感受态细胞经诱导表达筛选阳性克隆子,抽提重组质粒,进行DNA测序鉴定。结果转化大肠杆菌涂布平板长出阳性菌落,测序结果与所设计的STAT3 shRNA转录模板序列一致。结论所设计的shRNA编码序列被正确地插入到质粒骨架中,成功构建了STAT3基因的shRNA表达载体。

摘要：目的:建立一种能同时检测幽门螺杆菌克拉霉素(23S)、喹诺酮(gyrA)耐药位点和人PPI代谢相关CYP2C19的基因多态性情况的基因芯片检测方法。方法:通过分析筛选人基因组CYP4502C19*2,CYP4502C19*3及幽门螺杆菌克拉霉素和喹诺酮类耐药位点的DNA序列,设计制备了HP感染个体化药物治疗检测基因芯片,并对其特异性、灵敏度、重复性进行了评价。结果:该芯片可以检测出不低于103CFU/ml的幽门螺杆菌和不低于2ng/μl的人基因组DNA。196例临床标本的芯片检测结果与测序结果基本一致。结论:应用可视化基因芯片进行幽门螺杆菌感染个体化药物治疗相关基因检测具有较高的特异性和敏感性,结果准确且易判读,具有较好的应用前景,可以为临床医生提供用药指导。

摘要：目的:10-23型脱氧核酶是脱氧核糖核酸酶中的一种,能主动在RNA分子嘌呤-嘧啶结合点切割所有RNA分子,通过比较反义寡核苷酸的作用,初步研究10-23型脱氧核酶对基因表达抑制作用的发生机制。方法:采用体外转录GFP mRNA与脱氧核酶反应,以及GFP表达质粒与脱氧核酶共转染HeLa细胞,观察脱氧核酶对GFP的抑制作用。结果:体外和胞内实验均显示据靶点设计的10-23型脱氧核酶对绿色荧光蛋白mRNA具有切割作用。当10-23型脱氧核酶的两翼结合臂各具有连续8碱基互补而处在两翼结合臂和酶解核心连接处的2碱基错配时,尽管不能切割mRNA但是在胞内仍然有表达抑制作用;而当两翼结合臂具有4互补碱基紧接1错配碱基和4互补碱基时,10-23型脱氧核酶体外和胞内均丧失作用。结论:10-23型脱氧核酶对基因较强的表达抑制作用来自结合臂的反义寡核苷酸依赖的RNase H降解,和本身对mRNA直接切割作用的叠加,即10-23型脱氧核酶在细胞内具有对基因识别切割和诱导RNase H进行再切割的双重作用。

摘要：目的抗菌肽中存在的"固有基序"或"保守结构域"可决定其生物学活性,该研究拟验证包含人源性抗菌肽h Glyrichin中保守结构域肽段的生物学活性。方法在前期研究基础上,分别设计合成了h Glyrichin来源且包含其保守结构域的多肽1与多肽2,分别利用菌落计数法及细菌生长曲线对其抗菌活性进行评价。结果上述包含保守结构域的多肽均具备较好抗菌活性,且在保持保守结构域完整的前提下,所合成多肽长度越短,其抗菌活性越强。除可有效抑杀细菌之外,所合成多肽对人红细胞未产生溶血作用。结论 h Glyrichin中同样存在保守结构域,含有此保守结构域的多肽具备良好杀菌活性,且对正常人体细胞无害。

摘要：目的基于基因芯片技术建立一种能快速甄别粪肠球菌、屎肠球菌及万古霉素耐药基因的检测方法。方法根据Gen Bank中查找的2种常见肠球菌特异性基因序列(ddl)及万古霉素耐药基因(van A,van B)序列,设计与合成用于检测肠球菌的特异性基因及耐药基因的引物和探针,制备耐万古霉素肠球菌(VRE)检测基因芯片。利用多重不对称PCR法扩增样品中的特异性基因与耐药基因片段,标记产物与基因芯片上的探针杂交,经清洗、化学发光法显色后进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交反应和化学发光法检测条件下,评价芯片的特异性、灵敏性和重复性。结果共筛选出1对通用引物、4对特异性引物和1条细菌通用探针、4条特异性检测探针。该芯片具有良好的特异性和重复性,灵敏性可达103CFU/ml。10例临床分离株样本的芯片检测结果与药敏实验基本一致(8/10)。结论初步建立了检测VRE的基因芯片方法,利用此方法可以甄别2种VRE种类并检测其耐药基因。

摘要：目的建立一种高通量、快速、准确甄别3、7、14、11和55型腺病毒的化学发光基因芯片方法。方法从GenBank中查找这5种腺病毒特异性基因保守区,设计分型的探针并在筛选后进行合成,用于制备寡核苷酸基因芯片。运用多重不对称PCR法扩增特异性基因片段,将扩增产物与基因芯片上的特异性探针杂交,经过洗涤、化学发光显色后,进行结果分析。在优化的多重PCR体系、杂交条件和化学发光检测条件下,对芯片的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果建立的基因芯片方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,检测质粒参考品最低检测限为3×10~3拷贝/反应,38例临床样本的分型结果与测序法结果基本一致(37/38)。结论建立了一种能快速、灵敏、特异区分5种腺病毒型别的基因芯片分型方法,为腺病毒分型提供一种新的检测手段。

摘要：目的改进对乙酰氨基酚口服溶液的处方,得到稳定、质量合格的制剂。方法优选对乙酰氨基酚口服溶液的溶媒、色素、矫味剂,及最佳配比。采用优化处方制备4批制剂,均澄清、质量合格。然后对其进行稳定性加速实验6个月,再进行质量检查。结果对乙酰氨基酚口服溶液的最佳制备处方为:丙二醇240 ml,甘油60 ml,组合玫瑰红天然色素0.05 ml,柠檬酸缓冲盐(pH=6)适量。结论该处方设计合理,所得制剂稳定且口感好,适合生产。