摘要：鹅副粘病毒分离株NA_1经 11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA ,采用RT_PCR扩增出与预期设计的 1 7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD 18_T载体 ,经纯化、筛选及酶切鉴定后 ,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆 ,并对阳性克隆进行测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为 174 0bp ,该基因的ORF总长为 1716bp ,编码 5 71个氨基酸。与GenBank下载的 15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列 ,发现所测NA_1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为 97 3% ,与F48E9同源性为 84 5 % ,与LaSota为 82 2 %。

摘要：根据大肠杆菌 O15 7Z4182基因设计 1对引物 ,并在其 5′端分别加入 Nco 、Xho 酶切位点 ,用聚合酶链反应(PCR)从本试验用的大肠杆菌 O15 7及 1株产志贺毒素大肠杆菌 (STEC) O8、1株肠道聚集粘附大肠杆菌 (EAgg EC)和 1株产肠毒素性大肠杆菌 (ETEC)菌株中也扩增出了 80 3bp的 DNA片段。以大肠杆菌 O15 7菌株 94H的 DNA为模板 ,用上述引物做 PCR,将其产物连接到载体质粒 p ET2 8a(+) ,然后转化到宿主菌大肠杆菌 L E392 ,从该菌中提取重组质粒 ,再将其转化到表达宿主大肠杆菌 BL2 1(DE3) ,用 PCR、限制性内切酶位点分析及核苷酸序列测定法对克隆的重组质粒进行鉴定 ,表明 Z4182基因定向克隆到了载体质粒 p ET2 8a(+)。将转化子培养并经 IPTG诱导后 ,做SDS- PAGE电泳 ,表明该菌株可以表达 Z4182基因。本试验为阐明大肠杆菌 O15 7Z4182基因的分布及探讨该基因产物的功能和致病作用奠定了基础。

摘要：从大肠杆菌 Acr A的编码序列中设计引物 ,以大肠杆菌基因组为模板 ,扩增出 Acr A基因中约 6 91 bp的 c DNA片段 ,将所得片段与 p MD- 1 8T载体连接 ,转化到 DH5α大肠杆菌中 ,成功地筛选到阳性克隆 ,其质粒测序结果与文献报道一致。从阳性克隆中提取质粒 ,经 Hind 和 Bam H 酶解 ,回收 6 91 bp的目的片段 ,定向克隆到 p ET- 2 8a表达载体中 ,提取质粒 ,再次转化到 BL2 1 (DE3)中 ,成功地筛选出阳性克隆。经 IPTG诱导阳性菌 ,通过 SDS- PAGE检测出Acr

摘要：首次对犬冠状病毒大熊猫株(CCVGP)核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。本实验根据GenBank中报道的CCVlnsavc-1株N蛋白基因序列,设计了一对特异性引物,对分离的CCVGP野毒株进行了RT-PCR扩增。将扩增的PCR产物纯化回收后与pGEM T连接得到重组质粒pTN,进行核苷酸序列测定。结果该基因全长1146bp,编码382个氨基酸;与CCⅤ标准毒株Insavc-lN基因相比,核苷酸的同源性为92 6%,推导的氨基酸的同源性为93 2%。在推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒N蛋白相应区域相同,推测可能是RNA结合区。预测的GP株N蛋白疏水性和抗原表位与Insavc-l株N蛋白存在细微的差异。将pTN双酶切,回收目的基因片段克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中构建了重组质粒pETN,转化大肠杆茵BL21,用IPTG进行了诱导表达。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为48KD的重组蛋白,免疫印迹法证实该重组蛋白可以与CCV多克隆抗体发生特异性反应。经凝胶薄层扫描分析,重组N蛋白表达量可占菌体蛋白的49 3%,表达的蛋白纯化后可用于建立检测大熊猫CCV抗体间接ELISA用的包被抗原。

摘要：在克隆AcrA、AcrB部分基因片段并进行基因及编码蛋白的同源性分析的基础上,设计合成构建AcrA、AcrB的内标准DNA所需引物,经过3次(12个)PCR成功地合成了AcrA、AcrB的内标准DNA。合成法构建定量RT-PCR内标准DNA快捷、成功率高。

摘要：根据巴氏杆菌磺胺耐药基因 Sul 序列设计引物 ,以临床分离的禽源巴氏杆菌磺胺耐药菌株为模板 ,扩增出禽源巴氏杆菌 Sul 的全长基因序列。经 T载体克隆和核苷酸序列测定 ,克隆的 Sul 基因与文献报道的同源性为98.9% ,有 9个碱基的差异 ,但所编码的氨基酸没有改变。将 Sul 基因按正向的阅读框架与表达载体 p ET- 2 8c(+)连接 ,重组质粒经酶切鉴定正确后 ,经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE检测 ,融合蛋白的表达产物占菌体总蛋白的 11% 。

摘要：根据巴氏杆菌链霉素耐药基因 Str A序列 ,设计合成 1对引物 ,以临床分离的禽源巴氏杆菌链霉素耐药菌株质粒DNA为模板 ,通过 PCR技术 ,扩增出禽源巴氏杆菌的 Str A基因片段。将长约 80 4 bp的 Str A目的基因克隆到 p GEM-T载体上 ,通过核苷酸序列测定 ,结果表明 ,克隆的 Str A基因长约 80 4 bp,与文献报道 (NC- 0 0 1774 )的同源性为99.8% ,只有 1个碱基不同 (6 9位 T→ C) ,但所编码的氨基酸没有改变。将 Str A基因按正确的阅读框架定向克隆到原核表达载体 p ET- 2 8c(+)中 ,重组质粒酶切鉴定正确后 ,将构建好的原核表达质粒 p ET- 2 8c(+) - Str A转化到受体菌BL- 2 1(DE3)中 ,经 IPTG诱导后 ,进行 SDS- PAGE电泳 ,经检测 ,Str A外源基因的表达产物占菌体总蛋白的 12 %。

摘要：将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段,F_1、F_2、F_3、R_6、R_5、R_4、F_4、F_5、F_6、R_3、R_2和R_1,采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F_1长38bp,R_1长36bp,其他片段均40bp长,F_1和R_1片段两端分别加上限制性内切酶NcoⅠ和XhoⅠ的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段。该片段与pMDI8-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致。表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。

摘要：首次对犬冠状病毒V1野毒株核蛋白(N)基因进行了克隆和序列测定。根据GenBank中报道的CCVInsavc-1株N基因序列,设计了1对特异性引物,对分离的CCVV1野毒株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的阳性PCR片段经纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pTN1,进行核苷酸序列测定,并与GenBank中CCV标准毒株Insavc-1N基因进行了比较。结果该基因全长为1146bp,编码382个氨基酸,两者核苷酸的同源性为91.7%;推导的氨基酸序列的同源性为90.2%,显示出较高的保守性。在V1野毒株推导的N蛋白N端156-179位存在一个SRXX富集区,与小鼠肝炎病毒相应区域相同,推测可能是RNA结合区。另外,推导的该蛋白氨基酸序列其疏水性和抗原表位与标准毒株Insavc-1N蛋白存在一定的差异;在氨基酸组成上,该蛋白丝氨酸和赖氨酸含量高达9.84%,提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。

摘要：参考已发表在GenBank中CSFVAlfort毒株的E2 蛋白基因序列 ,选择其抗原编码高变区作为扩增的靶区域 ,设计了一对特异性引物。用异硫氰酸胍 -酚 -氯仿一步法提取猪瘟病料细胞总RNA ,对其进行了RT -PCR扩增。结果得到了与设计大小 2 72bp完全相符的核酸带 ,并对PCR产物直接进行了核苷酸序列测定。将所测序列与中国C株同段序列进行了比较和分析。结果发现与中国C株核苷酸的同源性均为 82 .8% ;推导的氨基酸同源性为 88.3% ;两野毒株均有 33个碱基发生改变。并用此病料对 4 0日龄易感仔猪成功进行了人工感染试验 ,结果发现能引起比较典型的猪瘟临床症状和病理变化 。