摘要：根据奶牛α 乳清蛋白基因序列设计引物 ,用PCR方法扩增并克隆了牦牛 (Poephagensgrunnieus)α 乳清蛋白基因的全序列。结果表明 ,牦牛α 乳清蛋白基因长 2 999bp ,其中 1～ 670bp为 5′侧翼序列 ,2 690～2 999bp为 3′侧翼序列 ,在 671～ 2 689bp之间 ,共有 4个外显子和 3个内含子 ,牦牛α 乳清蛋白基因共编码 14 2个氨基酸 ,其中第 1～ 19氨基酸之间的短肽为信号肽序列。牦牛的α 乳清蛋白基因有较高水平的表达可能与基因内非编码序列碱基突变引起的回文结构消失有关。该基因 5′侧翼序列在结构上牦牛和牛基本相同 ,只有MGF因子识别位点稍有差别。且牦牛的该序列更符合Groenen等 1994年总结的该因子识别位点的模式序列 ,因此牦牛的该基因

摘要：背景:随着分子生物学和分子遗传学技术的发展和应用,人们利用基因工程方法进行人胰岛素的生产研究,并从分子水平再造分泌胰岛素的克隆细胞系来替代胰岛素注射和胰岛移植治疗糖尿病。目的:构建并筛选人胰岛素基因真核高效表达载体。设计:随机对照实验研究。单位:中国医科大学实验动物部。材料:实验选取健康成年清洁级昆明小鼠40只,雌雄各半,自由饮水,自由采食人工颗粒料,每日光照14h,实验动物由长春解放军军需大学实验动物中心提供。大肠肝菌DH5α和幼仓鼠细胞系由实验动物中心保存。方法:常规法构建重组质粒pEF1α-ImINS。将重组质粒pEF1α-ImINS和胰岛素其他3个重组质粒分别转染幼仓鼠肾细胞,经G418筛选,阳性克隆传至20代,分别用放射免疫和免疫组织化学技术方法分析胰岛素和/或胰岛素原在幼仓鼠肾细胞中表达的情况。并用重组质粒pEF1α-ImINS转染幼仓鼠肾细胞的阳性克隆20代的PBS细胞悬浮液(5×107细胞/只)及其培养上清(0.5mL/只)对昆明小鼠行腹腔注射,通过对注射前后小鼠血糖值测定,分析转基因产物降血糖的生物学效应。主要观察指标:胰岛素基因在幼仓鼠肾细胞中整合和表达的结果,以及注射前后血糖的变化。结果:胰岛素的表达量最高为7.984mIU/L,胰岛素表达水平的灰度值在幼仓鼠肾细胞质中为177.50±15.10,细胞核中为150.30±21.43;昆明小鼠注射pEF1α-ImINS转染幼仓鼠肾克隆细胞株的悬浮液后6h血糖值明显下降,与注射前24h比较,差异有极显著性意义(P<0.01)。结论:幼仓鼠肾细胞中重组质粒pEF1α-ImINS是胰岛素表达量最高的质粒;pEF1α-ImINS转染的克隆细胞株在小鼠体内有胰岛素表达,并且对正常小鼠有降血糖的作用。

摘要：设计合成3条引物,以载体pcDNA3.1-hAchE为模板,扩增出两端带有EcoRⅠ的约1.8 kb 去除信号肽但保留18 bp分子内伴侣序列的hAchE结构基因,及去除信号肽序列与分子内伴侣序列的hAchE成熟肽基因。将两个基因插入到酵母分泌型表达载体pPIC9和pHIL-S1,获得正向插入的4个分泌型酵母表达载体。为转化酵母,筛选分泌型高效表达hAchE菌株奠定了基础。

摘要：为使大肠杆菌热敏毒素LT的毒素活性丧失的同时仍保留其较强的免疫原性 ,实验依据LT基因的同源序列设计并合成 5条引物 ,采用突出末端PCR法和重组PCR法 ,将克隆于质粒pEWD2 99上的LT基因 ,分别引入BamHI、Ndel和xhol等位点 ,扩增出带有上述RE位点且含有m7和m112 突变点的约 110 0bp和约 80 0bp的DNA片段和不含突变点的约 30 0bp的DNA片段 ,使控制LT毒力活性中心的第 7位和第 112位氨基酸的碱基分别发生诱变 ,各DNA片段经分离、纯化、RE酶切和DNA连接酶连接后 ,插入经BamHI和Xhol双酶切的线性化的高效表达载体pGEX_4T_1的多克隆位点区 ,使LTm基因置于pTac强启动子下且与Thrombin蛋白基因融合表达 ,将连接产物转化入JM10 5菌株 ,挑出可疑阳性菌落 ,提取质粒 ,经酶切鉴定、PCR鉴定和DNA序列分析 ,证明读框正确 ,序列正确 ,获得了pGEX_4T_1(LTm7和pGEX_4T_1(LTm112 两个重组表达质粒。为运用基因工程手段大量生产人和动物大肠杆菌流行性腹泻的疫苗抗原和幽门螺杆菌疫苗的粘膜免疫佐剂 ,完成了基因水平的工作。

摘要：本文通过水溶沉淀法从赤芝子实体中提取出水溶性多糖.将多糖甲醇解后,以三甲基氯硅烷(TMCS)制备成三甲基硅(TMS)的衍生物,经气相色谱/质谱联机分析,确定灵芝多糖分子中含四组成分:阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖,他们的质量比大致为1:16;4.5:33.6.该提取方法简便有效,所用分析快速,灵敏度高.

摘要：根据GenBanK中Barrett报道的犬瘟热病毒Onderstepoort弱毒株的附着或血凝蛋白基因序列，设计合成了能扩增760bp基因片段的半套式引物。用异硫氰酸胍—酚—仿一步抽取法提取细胞总RNA进行反转录，再以此产物进行半套式PCR扩增，并筛选出最佳PCR扩增。结果经半套式PCR扩增能得到与设计片段大小相同的产物，并且不扩增犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验表明，此法能扩增出CDV强毒细胞培养物（毒价为10－5.8TCID50／0．1mL）10－6稀释的反转录产物，远高于常规PCR。经初步应用表明，此法可用于天瘟热的临床诊断和实验研究。

摘要：在利用计算机设计出检测流行性乙型脑炎病毒 ( JEV)、猪细小病毒 ( PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒( PRRSV)、猪伪狂犬病病毒 ( PRV)的多联 PCR引物的基础上 ,分别进行各单项 PCR检测相应病毒试验 ,确定了各单项 PCR反应条件范围 ,并对各 PCR扩增产物进行了点杂交和部分测序鉴定。用单项 PCR对感染猪相关病毒的检测证实 ,本试验已经建立了有效、特异、敏感的检测 JEV、PPV、PRRSV、PRV的单项 PCR技术 ,为进一步建立多联

摘要：首次对犬冠状病毒(CCV)V1株纤突蛋白(S)基因进行了克隆和测序。根据GenBank中报道的CCVV54株S基因序列,设计了一对特异性引物,对CCVV1野毒株S基因进行了RT-PCR扩增。将扩增得到的PCR产物纯化后克隆到pGEM-T中得到重组质粒pTS,用于序列测定。结果该基因全长4362bp,编码1453个氨基酸,N端前18个氨基酸为推测的信号肽序列,后1435个氨基酸构成成熟蛋白。将V1株S全基因与GenBank中已发表的6个CCV毒株S基因进行了比较,结果核苷酸序列同源性在91.0%～99.0%之间;推导的氨基酸序列同源性在93.0%～99.0%之间;同时发现CCV变异区主要集中在S基因前1/2处,其中350-370、439-478、1718-1818三个区域碱基变异较大,而1060-1700区碱基却十分保守。基于S全基因聚类分析结果表明,S基因分型结果与CCV毒力强弱并不一致;V1野毒株推导的S蛋白潜在的N-联糖基化位点与CCVV54强毒相同,均为34个,比Insavc-1弱毒多一个;其中第566-568位糖基化位点是多数强毒拥有而弱毒Insavc-1没有的。推导的V1株S蛋白疏水性及抗原表位与Insavc-1株有一定的差异,这些差别对病毒致病性和免疫原性等影响需进一步的研究。

摘要：根据 Gen Bank中 Barrett报道的犬瘟热病毒弱毒株 Onderstepoort的血凝蛋白基因序列 ,设计合成了一对能扩增 76 0 bp基因片段的引物。用异硫氰酸胍 -酚 -仿一步抽提法提取细胞总 RNA进行反转录 ,再以此产物为模板进行 PCR扩增 ,筛选出最佳扩增条件。结果以此对引物进行 PCR扩增能得到与设计片段大小相同的产物 ,并且不扩增犬细小病毒、犬 I型腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒的核酸。敏感性试验证实 ,此法能扩增出稀释 1 0 0 0倍的 CDV强毒细胞培养物 ( 1 0 5 .1 TCID5 0 /0 .1 ml)的反转录产物 ,其敏感性远高于电镜负染和荧光抗体染色法。经初步应用表明 ,此法可用于犬瘟热的临床诊断和实验研究。

摘要：以MS和 8114为基本培养基 ,通过调整激素种类与浓度等培养条件 ,按正交实验设计的原则 ,摸索出建立蓍草组织培养体系的最佳条件 :愈伤诱导最佳培养基为 8114+6BA1.0 +NAA1.0 +ZT1.0 ;最佳分化培养基为 8114+6BA4.0 +NAA0 .2 +ZT1.0 ;最佳生根培养基是 1/2MS0 +0 .1NAA .