摘要：目的建立人真皮成纤维细胞(HDF)高糖老化模型,探讨人蜕膜间充质干细胞(dMSC)来源外泌体对高糖老化HDF增殖、迁移、凋亡的影响及其可能机制。方法采用实验研究方法。收集2021年1—3月解放军总医院第四医学中心收治的4例男性包茎患者(18~22岁)环切术后废弃包皮组织,分离培养获取原代HDF。取第6代HDF,按照随机数字表法分为低糖组和高糖组,分别采用低糖完全培养基和高糖完全培养基进行每72小时换液、不传代培养,10 d后取细胞,于接种后24 h,采用β-半乳糖苷酶试剂盒检测细胞衰老情况;于接种后48 h,采用蛋白质印迹法检测细胞衰老相关蛋白p16、p53表达情况;于接种后24、48、72 h,采用细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测细胞增殖情况;于接种后48 h,采用脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色法检测细胞增殖情况,采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况;于接种后24 h,采用Transwell实验测定细胞迁移能力。取人dMSC培养48~72 h,采用差速高速离心法获取其外泌体,采用透射电子显微镜观察dMSC外泌体形态,采用纳米颗粒追踪分析法检测dMSC外泌体的粒径分布,采用蛋白质印迹法检测dMSC外泌体标志蛋白CD9、肿瘤易感基因101(TSG101)的表达。取dMSC外泌体及前述高糖完全培养基诱导老化的HDF共孵育24 h,采用PKH67试剂盒检测细胞摄取外泌体的情况。取前述高糖完全培养基诱导老化的HDF,同前分为单纯高糖组、高糖+低浓度外泌体组、高糖+高浓度外泌体组,分别于高糖完全培养基中加入等体积的磷酸盐缓冲液、终质量浓度为50μg/mL dMSC外泌体、终质量浓度为100μg/mL dMSC外泌体进行常规细胞培养。分组后同前于对应时间点采用CCK-8法和EdU染色法、流式细胞术、Transwell实验分别检测细胞增殖、细胞周期和凋亡及细胞迁移情况。根据前述结果,另取经高糖完全培养基诱导老化的HDF,分为单纯高糖组、高糖+高浓度外泌体组并同前处理。分组培养48 h,采用实时荧光定量反转录PCR法检测单纯高糖组和高糖+高浓度外泌体组细胞衰老相关的微小RNA-145-5p(miR-145-5p)、miR-498、miR-503-5p及其靶基因钙/钙调素依赖性蛋白激酶1D(CAMK1D)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(PTEN基因)和细胞周期蛋白D1的mRNA表达情况。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验和独立样本t检验。结果接种后24 h,高糖组HDFβ-半乳糖苷酶阳性染色率为(38.4±4.2)%,明显高于低糖组的(16.5±2.2)%(t=4.65,P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF的衰老相关蛋白p16和p53的表达量均明显高于低糖组(t值分别为11.85、3.02,P<0.05或P<0.01)。接种后24、48、72 h,高糖组HDF的增殖活性均明显低于低糖组(t值分别为4.13、9.90、15.12,P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF的EdU阳性染色率明显低于低糖组(t=3.83,P<0.05)。接种后48 h,高糖组HDF周期的G2/M+S亚群在3个亚群(G0/G1、S和G2/M)的占比明显低于低糖组(t=8.74,P<0.01)。接种后24 h,高糖组HDF穿过Transwell滤膜到达下室的细胞数量为(37±6)个,明显少于低糖组的(74±7)个(t=8.42,P<0.01)。接种后48 h,高糖组HDF凋亡率明显高于低糖组(t=8.48,P<0.01)。dMSC外泌体为边缘清晰、大小分布均匀的杯状或者圆形囊泡,粒径基本处于80~200 nm。dMSC外泌体标志性蛋白CD9、TSG101表达均呈阳性。共孵育24 h,外泌体被HDF摄入胞内,主要分布于细胞核周围。分组培养24、48、72 h,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于单纯高糖组(t值分别为6.36、6.10、7.76,8.92、12.17、10.74,P<0.01),高糖+高浓度外泌体组HDF增殖活性均明显高于高糖+低浓度外泌体组(t值分别为7.92、4.82、4.72,P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率均明显升高(t值分别为5.32、9.88,P<0.01);与高糖+低浓度外泌体组比较,高糖+高浓度外泌体组HDF EdU阳性染色率显著升高(t=5.27,P<0.01)。分组培养48 h,与单纯高糖组比较,高糖+低浓度外泌体组和高糖+高浓度外泌体组HDF中的G0/G1期亚群占比均显著降低(t值分别为3.81、4.31,P<0.05),G2/M+S亚群占比均明显升高(t值分别为3.

摘要：目的分析互联网云技术在耳鼻喉科在线教育中的应用,提高在线教育的教学质量。方法利用互联网云技术进行云查房及在线疑难病例讨论,定期举办教学云讲堂。采用随机抽样的方法,通过网络软件进行问卷调查,了解耳鼻喉科医生对当前在线教学的评价,分析在线教学需要改进的方面。结果大部分调查对象认同在线教育,认为在线教育是对传统教育的补充,可以更有效的利用时间和资源,希望多组织此类课程。在线教育需要改进的方面主要包括:互动交流困难,缺少实时反馈;答疑不如面对面交流领会快;网络不稳定经常卡顿。结论互联网云技术应用于耳鼻喉科在线教学,方便广大医生在专业领域了解行业进展,更新知识结构,提高教学质量。