摘要：目的获得编码人尿酸转运蛋白(humanuricacidtransporter,hUAT)的全长基因。方法从人肾小管上皮细胞株(HK-2)中提取总RNA,根据Genbank中hUAT基因序列设计特异性引物,然后通过RT-PCR法扩增目的片段。所得目的片段酶切后与载体pEGFP-C1连接,经酶切及序列分析鉴定。结果成功扩增出980bp的hUAT全长基因,克隆到pEGFP-C1载体后酶切分析结果与预期一致,序列分析结果与Genbank上公布的hUAT序列完全一致。结论成功克隆出hUAT基因,序列分析结果完全正确,为对该基因进一步研究奠定了基础。

摘要：目的探讨PCR法获得的shRNA对外源性基因和内源性基因表达的抑制效果。方法选择绿色荧光蛋白(GFP)和大鼠肾脏系膜细胞高丰度表达的纤维连接蛋白(FN)分别作为外源性和内源性基因的靶基因,设计特异性引物,利用PCR扩增获得shGFPRNA和shFNRNA。前者与pEGFP质粒共转染至293T细胞,48h后进行激光共聚焦检测细胞表达GFP阳性率;后者转染至大鼠系膜细胞(RMC)中,48h后提取总RNA逆转录成cDNA,经realtimeRTPCR检测FN的mRNA表达水平,提取细胞总蛋白进行Westernblot检测FN蛋白表达水平。结果PCR获得的shGFPRNA产物能有效抑制外源性基因GFP的表达,抑制效率可达70%±3.2%;shRNA转染组内源性基因FN的表达水平明显下降,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论PCR方法可快速简单、廉价地获得shRNA,对内源性或外源性基因进行特异性抑制。