摘要：目的探讨靶向乙型肝炎病毒（HBV）preC／C基因的小干扰RNA（siRNA）在人类肝癌细胞系Huh-7细胞和HepG2．2．15细胞中抗病毒基因治疗效果。方法根据GenBank中HBV（GenBank登录号U95551）基因组序列，设计合成靶向HBVpreC／C基因的3个长2l核苷酸（nt）的siRNA，设计1个对照的非同源长2Int的siRNA，分别克隆到pU6质粒中，构建3个shRNA表达载体pU6-C1，pU6-C2，pU6-C3和对照pU6-C4；为了检测siRNA功能建立报告基因系统，以pT-HBVl．3为模板，PCR合成目的基因preC／C，克隆到绿色荧光蛋白（EGFP）表达载体（pEGFP-N1）中构建携带EGFP报告基因的重组质粒***／C（E-C）。将构建的3个shRNA表达载体与E-C共转染Huh-7细胞，或将该3个shRNA表达载体共转染HepG2．2．15细胞。首先，在Huh-7细胞中使用荧光显微镜观察及流式细胞仪检测EGFP融合表达细胞计数，评估该shRNA在转染后不同时间对EGFP融合报告基因表达的抑制效应；接着在HepG2．2．15细胞中，运用ELISA检测转染后24、48、72和96h细胞上清中HBsAg和HBeAg的表达量；免疫荧光技术检测转染后72h细胞内HBsAg和HBcAg的表达水平；实时荧光定量PCR（real-timePCR）进一步检测HBVmRNA转录产物cDNA的拷贝变化。结果发现siRNA表达质粒与E．C共转染Huh-7细胞后48h，与pEGFP-N1单质粒转染相比，pU6-C1，pU6-C2或pU6-C3共转染组使EGFP表达水平降低了80％，而对照pU6-CA或pU6共转染组无显著降低EGFP的表达，差异有统计学意义（P〈0．01）；免疫荧光技术检测发现HepG2．2．15细胞内HBsAg和HBcAg表达显著降低，real-timePCR发现pU6．C1、pU6-C2或pU6．C3共转染HepG2．2．15细胞后48h，使mRNA转录产物的cDNA含量分别降低了73．9％±1，2％（P=0．029）、48．2％±1．8％和35．8％±1．4％（P：0．037，0．040），而不论pU6-CA或pU6对照共转染组均不能降低cDNA含量，差异均有统计学意义（均P〈0．01）；pU6-C1结果与显微镜观察／流式细胞仪细胞计数、ELISA和免疫荧光技术检测结果相吻合。抗病毒效果48h后作用明显，72h达到高峰。结论靶向preC／C基因的RNAi能够有效特异抗HBV在人类肝癌细胞系中的复制与表达。RNAi可能成为抗重大传染病HBV／HCV／HIV有效的基因治疗技术。