摘要：背景:前期研究发现,E1A激活基因阻遏子蛋白调控人血管平滑肌细胞的增殖及表型转化,但其表达调控细胞增殖、分化、凋亡的量效关系有待深入探讨。目的:建立强力霉素调控小鼠E1A激活基因阻遏子表达的NIH3T3细胞系,拟为定量观察E1A激活基因阻遏子的生物学功能提供研究基础。设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-05/2008-03在沈阳军区总医院全军心血管病研究所实验室完成。材料:强力霉素调控基因表达系统,3T3细胞系。方法:通过反转录-聚合酶链反应方法获得小鼠E1A激活基因阻遏子(mCREG)cDNA序列;将mCREGcDNA序列亚克隆入pRev-TRE载体中,构建强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达pRev-TRE-mCREG载体;分别经G418(新霉素)及潮霉素筛选表达pRev-Tet-On、pRev-TRE-mCREG的NIH3T3细胞克隆;反转录-聚合酶链反应鉴定转染细胞克隆中抗性基因和插入基因的表达。主要观察指标:Westernblotting检测不同浓度的强力霉素诱导后NIH3T3细胞中mCREG的表达。结果:成功构建了强力霉素可调控表达的pRev-TRE-mCREG重组载体;筛选出稳定表达双抗性基因的NIH3T3-mCREG细胞克隆;反转录-聚合酶链反应检测证实细胞克隆中G418及插入基因表达均为阳性;Western blotting检测发现随强力霉素诱导剂量的增加(0,0.01,0.1,1mg/L),NIH3T3-mCREG细胞中mCREG表达呈剂量依赖性增加。结论:成功建立强力霉素调控E1A激活基因阻遏子表达的小鼠NIH3T3细胞系。

摘要：背景:关于骨髓单个核细胞促使梗死心肌再生存在很大争议,早期研究均认为非常有效,甚至可以分化为心肌细胞,但最近的文献却基本否认了这种说法,认为单个核细胞仅可以有限的促进血管生成。目的:比较体外培养的脂肪干细胞和骨髓单个核细胞自体移植后对促进心肌细胞再生、血管新生及心肌梗死后心功能改善之间的差别。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2004-01/2005-09在解放军总医院心内科实验室与沈阳军区总医院实验室完成。材料:清洁级4月龄雄性新西兰白兔55只,10只用于骨髓单个核细胞标记追踪,剩余兔随机分为脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组、空白对照组,15只/组。方法:各组兔均结扎冠状动脉前降支制作心肌梗死模型,造模同时取少量腹部脂肪组织分离培养脂肪干细胞,抽取髂骨骨髓分离培养骨髓单个核细胞,用于自体移植。3周后再次开胸,脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组分别于梗死心肌直接注射自体脂肪干细胞和骨髓单个核细胞,空白对照组注射磷酸盐缓冲液。继续培养5周,将专用于骨髓单个核细胞标记追踪的10只兔行DAPI和BrdU标记,脂肪干细胞组的移植细胞行BrdU标记。主要观察指标:移植细胞标记情况。移植后心功能变化。苏木精-伊红染色和免疫组织化学检测结果。结果:脂肪干细胞组心肌梗死区可见大量移植细胞存在,可分化为心肌细胞、内皮细胞、参与新血管形成;骨髓单个核细胞组DAPI及BrdU标记后均未于梗死心肌组织发现单个核细胞存在。细胞移植前3组动物心功能基本相似;细胞移植后5周与空白对照组比较,脂肪干细胞组超声心动图及左心室压力曲线检测均显示心功能显著改善(P<0.05),骨髓单个核细胞组仅等容收缩期左心室压力最大上升速率明显改善(P<0.05)。脂肪干细胞组、骨髓单个核细胞组的血管密度均大于空白对照组(P<0.01,P<0.05),但前者于心肌梗死中心和边缘均可见大量血管,而后者仅在梗死区边缘血管密度增高。结论:脂肪干细胞移植可以促进心肌再生和新血管形成,进而改善心功能;而骨髓单个核细胞移植仅能促进血管新生,对心功能改善效果有限。

摘要：背景:血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制,小鼠E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)可以抑制血管平滑肌的增殖,成为心血管领域新的治疗靶点。目的:构建小鼠CREG小分子RNA干扰真核表达载体,下调小鼠细胞中CREG基因的表达。设计、时间及地点:观察性实验,于2007-04/10在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成。材料:小鼠成纤维母细胞系(NIH3T3)由美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理实验科李少华教授馈赠。方法:应用RNA干扰在线设计工具设计4对可与小鼠CREG基因cDNA结合的短发夹RNA。通过化学合成法合成并克隆至pEN_mH1c载体中,与目的载体pDS_hpEY进行LR重组得到4种表达不同shCREG片段的表达载体pDS_shCREGs。应用LipofectamineTM2000将pDS_shCREGs转染至小鼠NIH3T3细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。主要观察指标:应用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测CREG的沉默效率。结果:经酶切和DNA测序证实,4种重组pDS_shCREG载体中插入片段的序列正确。反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹证实,4种稳定转染细胞中的CREG表达水平均有不同程度的下降,稳定转染pDS_shCREG1的细胞克隆中CREG基因mRNA和蛋白表达分别降低了87%和70%。结论:成功构建小鼠CREG基因真核干扰表达载体,使体外培养NIH3T3细胞中CREG蛋白表达明显降低。

摘要：背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞。目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性。设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011TM。pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、***载体购自Invitrogen公司。方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP。再从pSM2C中用HindⅢ/ClaⅠ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到***中,构建pSuper-PAC。最后BgⅢ/AccⅠ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆。诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆。对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色。主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果。②pac基因扩增。③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况。结果:HindⅢ/ClaⅠ双酶切得到261bp,664bp,5000bp3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功。Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功。转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性。结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP。成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性。

摘要：目的:本研究探讨白细胞介素23受体(Interleukin 23 Receptor,IL23R)基因单核苷酸多态位点(rs1884444与rs6682925)与中国北方汉族人群冠心病发病的相关关系。方法:本研究采用病例-对照的设计方法,收集568名冠心病患者以及45岁以上、年龄及性别匹配的524名正常对照个体为研究对象,采用测序法检测IL23R rs1884444与rs6682925单核苷酸多态性基因型,分析IL23R基因rs1884444与rs6682925单核苷酸多态位点的基因型及等位基因的分布情况。结果:IL23R rs6682925与rs1884444单核苷酸多态位点的基因型频率符合Hardy-Weinberg定律。IL23R基因rs6682925单核苷酸多态位点的三种基因型分布频率(CC型,TC型和TT型)在冠心病组为22.9%,39.6%和37.5%,在对照组分别为41.7%,47.2%和11.1%,IL23R基因rs6682925单核苷酸多态位点C等位基因是冠心病发病的一个独立的危险因素(P0.05)。Logistic回归校正性别、年龄、体重指数、吸烟、高血压、高脂血症、糖尿病等冠心病的易患因素后,IL23R基因rs6682925 C等位基因仍是冠心病发病一个独立危险因素。结论:在中国北方汉族人群中,IL23R基因rs6682925 C等位基因可能是冠心病发病的独立危险因素。

摘要：背景:胚胎干细胞来源的平滑肌细胞是血管组织工程潜在的细胞来源之一,但这些细胞是否具有成熟平滑肌细胞的表型和功能仍不清楚。目的:对小鼠胚胎干细胞分化的平滑肌细胞进行表型鉴定及功能分析。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。材料:清洁级孕12.5d昆明小鼠1只用于制备饲养层细胞,SD大鼠1只用于制备主动脉平滑肌细胞。小鼠胚胎干细胞系R1、小鼠微血管内皮细胞系由美国ATCC公司提供,转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1由本实验室制备。方法:①诱导分化及筛选:用转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1制备拟胚体,拟胚体悬浮培养5d后贴壁培养1d,第7天加入全反维甲酸诱导分化4d,第11天用10mg/L嘌呤霉素对诱导分化后的细胞筛选2d。②表型鉴定:对筛选到的平滑肌细胞进行SMα-actin、SM22α、SM-MHC免疫荧光染色,以大鼠原代主动脉平滑肌细胞、未经筛选的第10天分化细胞作为对照,进行WesternBlot分析。③收缩功能:10-5mol/L卡巴可处理筛选到的平滑肌细胞30min。④体外成血管功能:将等量的内皮细胞和筛选到的平滑肌细胞混合,在Matrigel上培养。主要观察指标:平滑肌细胞标志物的表达,平滑肌细胞的收缩,平滑肌细胞向内皮管腔样结构的募集。结果:分化的平滑肌细胞主要分布于贴壁生长的拟胚体的外周部位,胚胎干细胞来源的平滑肌细胞3种标志物SMα-actin、SM22α、SM-MHC免疫荧光染色均呈阳性表达,WesternBlot结果显示其SMα-actin、SM22α表达水平与大鼠原代主动脉平滑肌细胞相似,高于未经筛选的第10天分化细胞。筛选到的平滑肌细胞在10-5mol/L卡巴可刺激下出现明显收缩,且能够募集到内皮管腔样结构周围。结论:小鼠胚胎干细胞来源的平滑肌细胞具有与成熟平滑肌细胞相似的表型和功能。

摘要：膜周部室间隔缺损(室缺)是最常见的先天性心脏病。自从本世纪初Amplatzer膜周型封堵器被广泛应用于膜周部室缺介入封堵治疗。同时新型改良设计的Amplatzer封堵器陆续问世,以及多种Amplazter封堵器非常规应用于膜周部室缺封堵,并开展了大量的临床应用研究。目前由于应用初代Amplatzer膜周型封堵器后近期或远期完全性房室传导阻滞并发症发生率较高,许多中心放弃了对其继续研究应用。对于完全性房室阻滞的机制深入探究以及封堵器选择应用进一步优化,将使Amplatzer封堵器在临床中具有广泛的应用空间,并为膜周部室缺的介入封堵治疗提供了新的思路。