摘要：背景:骨髓间充质干细胞具有可诱导分化为成骨细胞及成软骨细胞,利用DNA甲基化抑制剂5-氮杂胞苷可诱导间充质干细胞表达生肌调控因子中的Myf5及生肌素,可以使间充质干细胞定向分化为成肌细胞。目的:通过筛选蛋白含量最高时相的肌损伤浸液作用于骨髓间充质干细胞,探讨肌损伤浸液对间充质干细胞增殖及成肌诱导作用。设计:标准对照实验。单位:解放军第三军医大学预防医学院复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室。材料:Balb/C纯系小鼠18只造成肌肉组织的创伤模型,用于肌损伤浸液的提取,同时以5-氮杂胞苷诱导的间充质干细胞成肌组进行对照。方法:实验于2001-04/2003-09在第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤及复合伤国家重点实验室进行。Bradford比色法检测不同时相肌浸液蛋白含量,筛选蛋白含量最高时相的肌损伤浸液作用于骨髓间充质干细胞,于0,3,6,9,12,15d采用四甲基偶氮唑盐法检测伤浸液对间充质干细胞增殖的影响,与未加浸液的间充质干细胞作对照。采用反转录聚合酶链反应法检测其作用后6d生肌素的表达,并与用5-氮杂胞苷诱导的间充质干细胞成肌分化进行对照。主要观察指标:Balb/c小鼠①肌损伤浸液蛋白含量测定。②肌损伤浸液对间充质干细胞增殖的影响。③以生肌素的表达观察肌损伤浸液对间充质干细胞的成肌诱导作用。结果:①肌损伤浸液蛋白含量分析:以损伤后12h为最高。②肌损伤浸液对间充质干细胞增殖的影响:伤浸液作用组间充质干细胞的增殖活力在各时相均明显高于对照组。③肌损伤浸液对间充质干细胞的成肌诱导作用:伤浸液作用组无生肌素的表达,5-氮杂胞苷作用组有较强的生肌素表达。结论:肌损伤浸液可促进间充质干细胞的增殖,但对间充质干细胞无成肌诱导分化作用。

摘要：背景:机体受创后尤其是骨折发生后,骨髓间充质干细胞将启动成骨分化,其表面多种生长因子如碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子、骨形态发生蛋白的受体表达将发生变化。目的:观察骨折损伤后不同时相骨髓间充质干细胞表面转化生长因子受体的表达变化。设计、时间及地点:对照观察实验,于2002-02/2003-11在解放军第三军医大学预防医学院复合伤研究所创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。材料:选用健康成年兔,建立成兔桡骨骨折模型。方法:在造模当日及造模后1,5,10,15,20d抽取实验兔骨髓液,取骨髓有核细胞,纯化间充质干细胞,成骨分化培养基诱导培养。主要观察指标:通过Western-blot法检测转化生长因子β1,β2受体在间充质干细胞上的表达。结果:造模后1d转化生长因子β1受体表达与造模当日比较无明显差异(P>0.05);造模后5d,其表达显著高于造模当日(P0.05),但显著高于造模当日(P0.05);造模后10,15d,其表达显著高于造模当日(P<0.05);造模后20d转化生长因子β2受体的表达显著高于造模当日及造模1,5,10,15d(P<0.01)。结论:创伤后体内骨髓间充质干细胞成骨分化过程中转化生长因子β1,β2受体的表达呈现逐渐增高的趋势。

摘要：背景:人羊膜含胶原、糖蛋白、蛋白多糖、整合素和板层体等多种成分,表达多种生长因子及其mRNA的相关蛋白,能为细胞的增殖、分化提供丰富的营养成分,有利于细胞的生长繁殖,其能否负载培养猪骨髓间充质干细胞良好生长值得研究。目的:建立人羊膜负载培养猪骨髓间充质干细胞生长的组织工程方法,观察骨髓间充质干细胞生长增殖的形态特点。设计:随机对照观察。单位:创伤、烧伤和复合伤国家重点实验室,解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所。材料:实验于2003-01/11在解放军第三军医大学预防医学院全军复合伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。选用3只出生二三个月的贵州小香猪,雌雄不拘,体质量6～8kg,由解放军第三军医大学实验动物中心提供。主要试剂:IMDM培养基(Hyclone,USA);优质胎牛血清PAA(Germany);Eosin B(Sigma,USA);OCT包埋剂(USA)。主要仪器:BX51立式荧光显微镜(Olympus,Japan);IX70型倒置荧光显微镜(Olympus,Japan);恒冷切片机(2700-Frigcut,德国);骨髓穿刺针(江苏);超净工作台(苏净集团安泰公司);CO2恒温培养箱(QUEUE,USA)。方法:按文献所述方法准备人羊膜,将按文献所述方法分离、培养的贵州小香猪骨髓间充质干细胞贵州小香猪的骨髓间充质干细胞原代培养、传代扩增后,以不同密度(0.84×105/cm2,1.54×105/cm2,2.75×105/cm2)接种于人羊膜基质面,倒置显微镜及扫描电镜下观察不同培养密度骨髓间充质干细胞的生长增殖变化情况;将第2、3代骨髓间充质干细胞以1.54×105/cm2的密度作为合适种植密度接种到由聚酯环支撑的人羊膜的基质面,最长培养至18d,逐日经卷膜、切片、苏木精-伊红染色光镜下观察人羊膜负载骨髓间充质干细胞生长情况,同时给予扫描及透射电镜。主要观察指标:不同培养密度及不同时间点骨髓间充质干细胞在人羊膜上的生长情况。结果:①不同种植密度人羊膜促进骨髓间充质干细胞生长比较:倒置显微镜下,以0.84×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞排列不规则、稀疏,间距大;以1.54×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞生长排列规则,密度适中,24h前细胞轮廓清楚,细胞活性好;以2.75×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞拥挤生长,12h后不见细胞轮廓,多见非贴附细胞,随时间的推移,细胞老化快,细胞碎屑多见。扫描电镜下,以0.84×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,胞体肥大,呈不规则的长多边形扁平状,见粗细突起,细胞间距大;以1.54×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞密度适中,胞体肥大,呈不规则的长多边形扁平状,粗细突起较多,突起相互连接交织。细胞边缘有重叠现象;以2.75×105/cm2细胞密度接种的骨髓间充质干细胞,细胞拥挤重叠生长,周围突起不明显,边缘卷折,细胞碎屑多见。②不同时间点人羊膜负载骨髓间充质干细胞生长情况:倒置显微镜下,骨髓间充质干细胞接种在人羊膜的基质面后很快贴附生长,30min内就可见到骨髓间充质干细胞在人羊膜基质面上的贴附生长象。24h后可见几乎全部骨髓间充质干细胞贴附生长,细胞活力好,折光度强,48h后融合为单层,第4￣18天可见骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面密集生长。苏木精-伊红染色可见骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面呈放射状、漩涡状或平行生长,胞体较大,呈梭形,胞核居中、深染、大而清晰,细胞形态较为一致;扫描电镜下,骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面生长4d,排列密度适中,胞体肥大呈不规则的长多边形扁平状,粗细突起丰富,部分突起相互连接交织成网,胞膜形成突起牢固粘附于人羊膜基质上;透射电镜下,骨髓间充质干细胞在人羊膜的基质面生长4d切面,骨髓间充质干细胞在人羊膜上大多呈双层生长,细胞呈纺锤状,胞核两端胞浆突起较长,互相重叠,染色质以常染色质为主,核仁明显,可见丰富细胞器,如粗面内质网,线粒体。结论:人羊膜对骨髓间充质干细胞有明显的促增殖作用,骨髓间充质干细胞可以人羊膜为载体在体外进行培养,人羊膜是骨髓间充质干细胞的良好载体。