摘要：背景与目的:利用小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)抑制哺乳动物基因表达已成为研究基因功能的一种有效方法。本研究采用siRNA抑制人神经胶质瘤细胞系U-87细胞上容积调控氯通道ClC-2基因的表达,观察其受抑制后对细胞增殖能力的影响。方法:设计和构建两个针对人ClC-2基因的siRNA真核表达载体,并给予酶切鉴定和DNA序列分析鉴定;用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒***-shRNA和两个重组质粒***-shRNA-ClC-21、***-shRNA-ClC-22分别转染入U-87细胞(依次为PP0组、PP1组和PP2组);采用RT-PCR检测ClC-2mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期;平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果:目的片段成功地连接到真核细胞表达载体***上。PP1组、PP2组与对照组、PP0组相比较,ClC-2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期:细胞的G1期百分含量分别增加了约30.24%、18.04%(P<0.05)。平板克隆形成试验发现,克隆形成率PP1组[(11.0±1.0)%]、PP2组[(20±3.1)%]明显低于对照组[(46.5±1.6)%]和PP0组[(47.5±2.8)%](P<0.01)。结论:干扰人神经胶质瘤细胞系U-87细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的增殖,提示ClC-2基因可能成为控制人恶性胶质瘤生长的新靶点。

摘要：目的:采用人工神经网络模型及在线软件BIMAS和SYFPEITHI共同预测汉滩病毒核蛋白HLA-A)02限制的CTL表位,并对CTL表位进行实验鉴定。方法:①选取2004-11解放军第四军医大学唐都医院住院的肾综合征出血热患者1例,汉滩病毒特异性IgM抗体为阳性。无菌抽取肾综合征出血热患者外周血,分离外周血单个核细胞,液氮冻存备用。②采用JavaNNS软件模拟神经系统对信息的处理过程,建立人工神经网络模型。训练人工神经网络的9肽包括584种HLA-A)02结合肽和130种HLA-A)02非结合肽,随机数字表法分为3部分:80%为训练肽(用来训练模型,使其学习其中隐含的规律),10%为确认肽(防止训练过度,使训练在适当的时候终止),10%为试验肽(对训练好的模型进行初步的评价)。无、低、中、高亲和力9肽训练人工神经网络的输出值分别为0.1,0.4,0.6,0.8。因此,人工神经网络模型的默认阈值为0.4。此外,还应用在线软件BIMAS和SYFPEITHI,共同预测汉滩病毒核蛋白的CTL表位。③采用ELISPOT鉴定汉滩病毒核蛋白特异的HLA-A)02限制的CTL表位。结果:①人工神经网络、BIMAS和SYFPEITHI预测的准确度:3种方法预测的灵敏度分别达到0.89,0.78,0.97,特异性分别为0.90,0.87,0.20。三者共同预测到23个汉滩病毒核蛋白特异的CTL表位。②HLA-A)02限制的CTL表位的实验鉴定:在可刺激肾综合征出血热患者外周血单个核细胞产生阳性反应的3条15肽中,预测到了4个HLA-A)02限制的CTL表位。经ELISPOT实验证实,其中的2种9肽可刺激HLA-A)02阳性的肾综合征出血热患者外周血单个核细胞分泌γ干扰素。结论:肾综合征出血热患者中存在着汉滩病毒特异的CTL应答。汉滩病毒核蛋白CTL表位的有效预测,大幅度减少了合成候选9肽的数量,降低了成本。为肾综合征出血热细胞免疫应答的研究以及多肽疫苗的设计,奠定了重要基础。

摘要：背景:基因治疗已成为恶性肿瘤研究领域的热点和发展趋势,但舌癌基因治疗的研究报道极少。目的:构建含相关死亡结构域蛋白(FADD)及肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)基因功能结构域的融合基因TFL,稳定转染入人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113)中,检测建系细胞T-TFL的生物学性状,探讨一种更有利于舌癌患者治疗期及治疗后期内生活质量的治疗手段。设计:以诊断为依据,前瞻性研究。地点和对象:实验在第四军医大学口腔医学院口腔颌面外科完成,研究对象为人舌鳞状细胞癌细胞系(Tca-8113),上海第二医科大学口腔医学院建系。干预:反转录PCR获得人FADD及TNFR1基因cDNA,重组PCR法构建含二者功能结构域的融合基因TFL,通过阳离子脂质体法稳定转染TFL基因入Tca-8113细胞中。主要观察指标:Westernblot检测融合蛋白TNFR1/DED表达,通过形态学观察、生长曲线等检测T-TFL细胞的生物学性状。结果:获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL,转染入Tca-8113细胞后,能表达融合蛋白TNFR1/DED活性,且T-TFL细胞与亲本Tca-8113细胞的生物学性状无明显差异。结论:T-TFL细胞能表达融合蛋白TNFR1/DED活性,可以为进一步深入研究舌癌基因治疗提供实验基础。

摘要：背景:在生物进化中高度保守的抗原往往具有重要的生物学功能,也是不同种属动物执行相同或相似生物学功能的需要。然而细胞膜保守蛋白质分子的分离与鉴定仍然是蛋白组学的一个瓶颈。目的:探索鉴定细胞膜表面保守蛋白质分子的方法。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-09/2007-12在解放军第四军医大学免疫教研室完成。材料:BALB/c小鼠。Hela、293T、ECV304、Raji、Colo205、PLA801、7901、Jurkat、L929、SP2/0和CHO等细胞均由解放军第四军医大学免疫教研室冻存。方法:将人宫颈癌细胞系Hela免疫BALB/c小鼠,B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,应用Hela、人结肠癌细胞系Colo205、小鼠成纤维细胞系L929、3T3和中国仓鼠卵母细胞系CHO等细胞进行花环形成系统筛选共阳性杂交瘤,并应用Colo205、人Burkitt淋巴瘤细胞系Raji、人肺癌细胞系PLA801、人胃癌细胞系7901、人T细胞白血病细胞系Jurkat等肿瘤细胞系、胚胎细胞系人胚肾上皮细胞系293T、人脐静脉内皮细胞系ECV304、健康人外周血单个核细胞、小鼠细胞系L929、SP2/0、中国仓鼠细胞系CHO等对所制备的单克隆抗体进行活细胞免疫荧光染色和流式细胞仪鉴定。超速离心法提取Hela、Raji和小鼠Sp2/0细胞膜蛋白,亲和层析法纯化保守蛋白,SDS电泳后切下的目的蛋白带,应用质谱仪(LC-ESI-MS/MS)对酶解的肽进行氨基酸序列分析。主要观察指标:①红细胞花环形成筛选方法的建立。②筛选保守抗原单克隆抗体。③单克隆抗体对细胞膜蛋白的免疫沉淀。④质谱分析。结果:制备了1株可同时识别人肿瘤和胚胎细胞系、小鼠和仓鼠细胞系保守抗原的单克隆抗体C1,并应用该抗体通过亲和层析和质谱分析发现了1个保守蛋白候选分子,是一个目前尚未命名的、含1个V样结构域和3个C样结构域的IgSF成员。结论:亲和层析-质谱法是一种鉴定细胞膜保守分子可行性较好的方法。

摘要：背景:目前国内外对白细胞相关免疫球蛋白样受体(leukocyte-associated immunoglobulin like-receptor,LAIR)家族中LAIR1的生物学功能研究已较清晰,而关于LAIR-2分子在机体内的生物学功能尚缺乏相关报道。目的:为进一步研究LAIR-2的体内生物学功能,构建其真核表达载体,纯化并鉴定蛋白。设计、时间及地点:单一样本观察实验,于2007-06/2008-06在解放军第四军医大学完成。材料:载体pIg/3c由英国牛津大学徐小宁博士惠赠。载体pcDNA3.1由荷兰Meyaard博士惠赠。中国仓鼠卵巢细胞系CHO由解放军第四军医大学免疫学教研室冻存。方法:构建pIg/3c-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2两个真核表达载体,电转染法转染CHO细胞建立稳定表达LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全长蛋白分子的细胞株,通过Westernblot、细胞免疫化学、流式细胞术分析实验鉴定真核表达LAIR-2蛋白分子与抗原核表达LAIR-2mAbs的结合活性。主要观察指标:稳定转染细胞系的建立及真核表达蛋白的纯化和鉴定。LAIR-2蛋白与相应单克隆抗体的结合活性。结果:构建真核表达载体并成功转染CHO细胞,建立稳定分泌LAIR-2-Fc融合蛋白的转染细胞系及稳定分泌LAIR-2蛋白的转染细胞系,分别命名为CHO/LAIR-2-Fc以及CHO/LAIR-2。Westernblot实验表明真核表达的LAIR-2全长蛋白分子均可与三株抗LAIR-2mAb1A7、3H12及4A9发生特异性结合反应。免疫细胞化学、流式细胞术分析实验结果表明抗原核细胞表达蛋白的三株LAIR-2单克隆抗体中,1A7不能结合pcDNA3.1-LAIR-2转染的CHO细胞内的LAIR-2,面3H12和4A9均可以很好结合细胞内的LAIR-2。结论:实验成功构建了pIg/3c-LAIR-2及pcDNA3.1-LAIR-2两个真核表达载体,成功转染CHO细胞并建立稳定表达LAIR-2-Fc融合蛋白及LAIR-2全长蛋白分子的细胞株。真核表达的LAIR-2蛋白分子与抗原核表达的LAIR-2mAbs有良好的结合活性。

摘要：目的探讨下调婆罗双树样基因4(SALL4)对肾癌ACHN细胞周期和细胞凋亡的影响。方法根据人SALL4的mRNA序列设计合成靶向SALL4的小干扰RNA(siRNA),用于沉默ACHN细胞SALL4的表达。运用实时定量PCR(qRT-PCR)和Western blot法分别检测SALL4的mRNA与蛋白表达水平;使用流式细胞术检测ACHN细胞的细胞周期和细胞凋亡情况。结果 SALL4 siRNA可显著下调ACHN细胞中SALL4的mRNA和蛋白表达水平,下调SALL4后ACHN细胞的细胞周期受到抑制,G1期细胞增多,S/G2期减少,细胞凋亡显著增加。结论下调SALL4基因表达可抑制肾癌ACHN细胞增殖并促进其凋亡,SALL4可能是肾癌治疗的新靶点。

摘要：背景:通过筛选小鼠反转录病毒cDNA文库和质谱分析的方法鉴定出一种跨膜的胶原XVII是白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2的配体之一,然而,二者的其他配体尚未得到鉴定。目的:采用生物信息学法鉴定白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2(CD305/306)的候选配体分子。设计、时间及地点:生物信息学预测及生物学方法验证,于2006-03/2007-09在第四军医大学免疫教研室完成。材料:人WISH和Hela细胞系由第四军医大学免疫教研室冻存。方法:应用生物信息学方法搜索白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2序列同源分子,并通过文献检索初步推测白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2的配体候选分子。最后应用候选分子基因转染K562细胞,并应用白细胞相关免疫球蛋白样受体1-Fc/白细胞相关免疫球蛋白样受体2-Fc融合蛋白进行活细胞荧光染色,流式细胞术分析鉴定候选分子是否与融合蛋白结合。同时,合成两对候选分子的引物,提取高表达白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2配体分子的细胞系WISH的cDNA,进行巢式PCR,检测WISH中候选分子的表达情况。主要观察指标:应用人类基因组数据库对白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2分子氨基酸序列同源性比对结果,流式细胞术分析白细胞相关免疫球蛋白样受体分子是否与可能配体基因转染细胞结合,巢式PCR分析白细胞相关免疫球蛋白样受体配体高表达细胞是否表达可能配体基因。结果:应用生物信息学方法和文献检索初步推测白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2的配体候选分子为人类白细胞抗原G分子。经流式细胞术鉴定,白细胞相关免疫球蛋白样受体1-Fc/白细胞相关免疫球蛋白样受体2-Fc融合蛋白对人类白细胞抗原G基因转染的K562细胞的荧光染色结果为阴性;经巢式PCR鉴定,高表达白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2配体分子的WISH细胞系中未发现人类白细胞抗原G基因。结论:人类白细胞抗原G不是白细胞相关免疫球蛋白样受体1和白细胞相关免疫球蛋白样受体2的配体。

摘要：目的:构建靶向人C lC-2基因小分子干扰RNA(siRNA)真核细胞表达载体。方法:根据DEQOR提供的siRNA设计原则和程序,设计两个靶向C lC-2基因的发夹状siRNA;通过化学合成的方法合成两对分别互补的寡核苷酸链,退火后得到编码该siRNA的C lC-2基因片段。将该片段连接至经BglⅡ和HindⅢ双酶切的真核细胞表达载体***的多克隆位点,转化扩增提取质粒;对重组质粒进行EcoRⅠ和HindⅢ双酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定。脂质体L ipofectam ineTM2000介导瞬时转染,通过RT-PCR检测人胶质瘤细胞系BT-325细胞中C lC-2mRNA表达。结果:经酶切电泳鉴定和DNA序列分析鉴定,目的片段与真核细胞表达载体***连接正确。转染两重组质粒细胞的C lC-2 mRNA表达明显降低。结论:成功构建人C lC-2基因干扰真核表达载体2个,分别命名为***-siC lC-21和***-siC lC-22,可用于进一步研究C lC-2基因对人胶质瘤侵袭和迁移活动的影响。

摘要：目的观察抑制容积调控氯通道ClC-2基因的表达对胶质瘤BT-325细胞生长的影响。方法设计和构建两个针对ClC2基因的小干扰RNA(siRNA)重组表达载体,用脂质体LipofectamineTM2000介导转染,将空载体质粒和两个重组质粒分别转染入BT-325细胞(依次为对照组、PP1组和PP2组);通过RTPCR检测ClC2基因mRNA表达变化;MTT分析检测细胞活性;流式细胞仪检测细胞周期。结果与对照组相比较,干扰组ClC2基因的mRNA水平明显降低,细胞生长速度明显减慢,细胞周期进程被阻滞在G1期。结论干扰胶质瘤细胞系BT-325细胞的ClC-2基因表达可以抑制细胞的生长,提示ClC2基因可能成为控制胶质瘤恶性生长的新靶点。