摘要：背景:骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticprotein,BMP)是诱导和促进种子细胞向骨细胞方向转化的最重要的细胞因子之一。天然BMP难溶解于培养基,对培养的种子细胞无法有效发挥作用;可溶性重组BMP虽可溶解于培养基,但价格昂贵,而且难于适时、适量的作用于种子细胞。基因治疗为上述问题的解决提供了新的思路。目的:转染外源BMP-3基因入成纤维细胞,筛选获得稳定表达BMP-3的阳性成纤维细胞克隆。设计:单一样本研究。单位:解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所。材料:成纤维细胞(NIH3T3细胞)由第四军医大学口腔医学院司徒镇强教授提供。方法:2000-04/2003-11在全军重点实验室第四军医大学全军骨科研究所实验室完成。采用脂质体转染的方法将外源BMP-3基因转染入NIH3T3细胞,G418筛选后寻找细胞集落,分离、培养,免疫组织化学鉴定,BMP-3染色阳性者为阳性BMP-3表达细胞克隆。主要观察指标:①NIH3T3细胞筛选浓度。②转染阳性细胞克隆的筛选。③筛选的细胞克隆内BMP-3的表达。结果:成功将BMP-3基因转染入NIH3T3细胞,经免疫组化筛选出阳性BMP-3表达成纤维细胞的克隆,建立了BMP-3稳定表达成纤维细胞株。结论:将BMP-3基因真核表达载体转染入成纤维细胞,并经筛选获得了可稳定表达BMP-3的成纤维细胞株,为将来骨组织工?

摘要：目的:使用骨钙素启动子构建骨组织特异性小发卡状RNA表达载体。方法:实验于2003-11/2004-09在解放军第四军医大学全军骨科研究所和全军整形外科中心完成。以HEK293细胞基因组为模板,利用聚合酶链反应扩增人骨钙素启动子。将骨钙素启动子、针对虫荧光素酶的小发卡状RNA编码序列和多腺苷酸信号依次克隆至pGL3-control载体的相应酶切位点,经双酶切鉴定和DNA测序证实后命名为pGL3-OCP-shLuc。将pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control分别共转染人胚胎肾细胞HEK293和人骨肉瘤细胞MG-63,48h后测定虫荧光素酶活性,计算相对活性。结果:使用特异性引物成功扩增出长度为830bp的人骨钙素启动子聚合酶链反应产物。DNA测序结果证实pGL3-OCP-shLuc中的小发卡状RNA表达框与设计完全一致。pGL3-OCP-shLuc与pGL3-control共转染HEK293细胞后,虫荧光素酶相对活性与对照组相比没有明显差异,而共转染MG-63细胞后虫荧光素酶相对活性显著降低,剔出效率约为69.8%。结论:成功使用人骨钙素启动子构建了小发卡状RNA表达载体,并实现了骨组织特异性RNA干扰,为将RNA干扰技术引入骨肉瘤基因治疗领域奠定了基础。

摘要：背景:神经组织再生的特殊性导致始终没有一种成熟和完整的系统来解决神经组织节段性损伤后的修复问题。利用组织工程的方法去实现这个目标具有极大的难度与挑战性。目的:研制一种可用于临床神经损伤修复的人工神经桥接物,并对其进行微观空间结构的研究。设计:开放性实验研究。单位:解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所。材料:实验于2001-11/2003-01在解放军第四军医大学西京医院全军骨科研究所完成。Ⅰ型胶原蛋白、Ⅳ型胶原蛋白、明胶购于美国Sigma-aldrich公司。方法:制备桥接材料:分别将Ⅰ型胶原蛋白和Ⅳ型胶原蛋白放入0.05 mol/L醋酸溶液中高速搅拌制成悬浊液,混合两种悬浊液保持4℃恒温搅拌,制成胶原蛋白和硫酸类肝素的悬浊液,抽真空静置后注入内径为3 mm的硅胶管中密封两端,分别以5种不同速度(10×10-5 m/s,5×10-5 m/s,2.5×10-5 m/s,1.0×10-5 m/s,1.0×10-6 m/s)进行冷淋、赋型。行大体观察。并将以不同速度制成的各组材料切成横截面、纵截面以及45°斜截面以备光学显微镜观察。同时在扫描电镜下进行内部微管结构的观察,并进行材料内部的微管直径的计算,实际孔径=(放大率×微管面积)÷(标尺长度×孔周长)。主要观察指标:①桥接材料的大体观察结果。②桥接材料的显微镜观察结果。③桥接材料的扫描电镜观察结果以及材料内部的微管直径。结果:①大体观察:制备出的材料均为规则的圆柱体,且外型均匀。柔韧性较好,质地均匀,弹性较强。②光学显微镜结果:材料外表面为全封闭结构,无孔裂;表面光滑平整,连续性好。③电镜观察结果:材料的外表面为叠瓦状,内部的微管结构均匀,走行一致,且基本相互平行;纵向走行的微管之间相互独立,且呈封闭状态,无互通的桥连管道相连接,与生物体神经的纤维束的走行特点完全相同。材料内部微管的横截面基本为圆型,形状较为规则,直径大小较为均匀。材料内部的微管连续性好,无中断或横隔,且微管的小梁壁连续性好,表面光滑,无褶皱。材料内部的微管直径为197.3～258.8μm。结论:利用生物相容性较好且可降解的胶原和明胶经混合溶解及冷淋后形成具有单一纵向微管的神经桥接物,具有与正常神经高度仿生的微结构,可用作基础研究与临床神经损伤修复的替代物。

摘要：背景:作为软骨组织工程的基质材料在体内降解过快或过慢,影响组织再生及塑形改建,是长期困扰学者们的难题之一。目的:在体外将骨髓基质细胞扩增、诱导为软骨细胞后,探讨以聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物为载体修复兔关节软骨缺损的可行性。设计、时间及地点:同体对比观察实验,于2002-06/2008-06分别在解放军第四军医大学全军骨科研究所及解放军空军总医院中心实验室完成。材料:选取2月龄新西兰兔36只,自双侧股骨转子处抽取骨髓4～6mL,行原代及传代培养,传代培养时培养液中含骨形态发生蛋白2(100μg/L),培养瓶底预涂高分子透明质酸诱导为软骨细胞。调整第3代细胞浓度为2.0×1010L-1,与聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物共培养24h,即制成聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物。方法:在36只兔髌股关节股骨髁部造成直径4mm,深达髓腔的缺损,在右侧36个膝关节植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物-细胞复合物,为实验组,左侧18膝植入聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物,为单纯载体组,另18膝造成缺损后作为空白对照。主要观察指标:术后4,8,12,24周取材,行大体及组织学观察,组织学评分。结果:单纯载体组与空白对照组在各时间点大体及组织学表现相似,故一并描述,统称为对照组。24周时实验组缺损内充填白色半透明新生软骨组织,色泽与正常软骨相似,质韧,表面平整,与正常软骨界限消失,表面细胞平行于关节面,深层细胞排列紊乱,有柱状排列的趋势,基质异染广泛,软骨下骨形成及潮线恢复正常,与周围正常软骨连接良好。对照组缺损边缘细胞呈团块状增生,底部为纤维组织。组织学评分经统计学分析,24,12周分别与8,4周时比较差异具有显著性意义(P<0.01),各时间点实验组与对照组比较差异具有显著性意义(P<0.01)。结论:用骨形态发生蛋白2和高分子透明质酸成功地在体外将骨髓基质细胞诱导为软骨细胞;聚乳酸/聚羟基乙酸共聚物在新生软骨形成的同时,逐渐降解吸收,是组织工程修复关节软骨缺损适宜的支架材料。

摘要：目的:构建能生成与骨保护素配体(osteoprotegerinligand,OPGL)同源的发卡结构小双链RNA的载体并验证其对OPGLmRNA的抑制效应。方法:根据大鼠的OPGL的基因序列,参考OPGLmRNA的空间结构,设计发卡结构小干预RNA(short-interferingRNA,siRNA)模版,并构建由U6启动子引导产生siRNA的质粒载体。转染大鼠骨髓基质细胞,48h后提取细胞总RNA,Northernblot,以OPGL与内参β-actin自显影产物的灰度比值来反映OPGLmRNA的表达情况,结果进行统计学分析。结果:成功获得U6启动子引导产生siRNA的质粒载体,转染骨髓基质细胞后细胞中OPGLmRNA的表达量随着质粒载体量的增加而减少。结论:U6启动子引导产生siRNA的质粒载体能有效的减低OPGLmR-NA的表达量从而抑制OPGL的表达。

摘要：目的:通过对1例中国遗传性多发性外生骨软骨瘤(hereditarymultipleexostosis,HME)家系临床资料的整理及在EXT18q23～24.1,EXT211p11～12的基因编码序列进行突变检测,寻找HME的致病基因,为发现该病临床表现的遗传学特点及发现新的基因突变以期待此研究可能预防遗传性多发性外生骨软骨造成患者肢体功能残存的发生。方法:在EXT1、EXT2基因内设计引物,经PCR和DNA测序对基因编码序列及其临近内含子进行突变检测。结果:在EXT1、EXT2的编码序列内没有发现突变。结论:排除了EXT1、EXT2为该遗传性多发性外生骨软骨瘤家系治病基因的可能,为进一步研究发现新的基因突变提供了可能。

摘要：目的:测试并比较自行设计的膨胀式椎弓根螺钉(ExpansivePedicleScrew,EPS)与CDH,USS椎弓根螺钉翻修后的最大轴向拔出力及周期载荷疲劳寿命,评价EPS螺钉的翻修作用。方法:20个新鲜小牛腰椎随机数字表法分成甲、乙两组,每组10个椎体。两组椎体的椎弓根处均预先植入直径6.5mmCDH螺钉,拔出螺钉造成螺钉松动脱出的脊柱模型。随机在每个椎体的一侧椎弓根处拧入EPS螺钉,甲组对侧拧入USS螺钉,乙组拧入CDH螺钉(直径均为7.0mm×40mm),再次拔出螺钉,记录翻修的最大轴向拔出力。对CDH,USS,Tenor,EPS螺钉加载频率5Hz,载荷200～250N,150万次的周期载荷进行内固定器械周期载荷疲劳实验。结果:CDH,USS,EPS螺钉翻修时最大拔出力分别为(1206.8±597.4),(1522.2±392.1),(2161.5±555.4)N。EPS螺钉的最大拔出力均显著高于CDH,USS螺钉(P<0.05)。疲劳试验完成后,4种螺钉均未发生疲劳现象。结论:EPS螺钉较其他非膨胀式椎弓根螺钉有更优越的翻修可靠性。

摘要：背景:由于人体实验骨组织取材困难,骨组织形态体视学观察测定受到一定的限制。动物实验研究克服了人体实验此方面的局限性,可通过骨组织形态体视学观察测量直接评价骨质量。目的:对大鼠进行运动与负荷实验,以探讨运动对青少年长骨发育影响的机制。设计:以实验动物为研究对象,随机对照的实验研究。单位:第四军医大学西京医院全军骨科重点实验。对象:实验于2002-01/04北京体育大学运动实验室及第四军医大学西京医院全军骨科重点实验室完成。雄性4周龄SD大鼠120只,根据体质量随机搭配分成12组,每组10只。方法:使大鼠进行不同强度的跑台运动,同时结合悬吊和负重模型,宰杀大鼠后做右侧胫骨不脱钙切片的四环素、钙黄绿素双荧光标记观察。采用体视学全视野无偏采样方法对不同强度运动和不同形式机械负荷的生长期大鼠骨量、骨结构、骨代谢等形态参数进行测试分析。主要观察指标:①不同强度运动组间大鼠胫骨骨组织形态参数变化。②不同形式机械负荷组间骨小梁静态和动态参数的比较。结果:低负荷运动组的骨的重量、骨量、骨结构和骨代谢等多项指标参数随增龄而增长或降低的变化较高负荷运动组和对照组规律。悬吊组骨矿沉积率显著减少,骨小梁相对体积显著减小、厚度明显增大、数量减少以及间距(或分离度)显著增大,其骨代谢生化标志物和生物力学性能低于低负荷运动组,而与对照组差异无显著性意义。负重组所有参数均与低负荷运动组相接近。其特点为骨形成和骨吸收活跃,但以骨形成为主;骨抵抗破坏的能力和抵抗变形的能力皆明显增强。结论:不同强度的运动对生长期大鼠长骨发育可产生不同的影响,低负荷运动对骨代谢、骨量、骨组织形态以及骨生物力学等方面的综合作用好于高负荷运动。提示儿童少年在运动过程中,适当增加重力负荷,将有助于提高骨代谢和骨的力学性能,进而可提高发育过程中骨的质量。

摘要：[目的]设计、制造一种可与人工表面关节结合的有限接触式股骨髁上型带锁髓内钉,构成人工半膝关节系统,用于提高儿童保肢手术效果。[方法]运用有限元方法对髓内钉锁钉不同置入角度(锁钉与髓内钉横断面的夹角)0°、15°、30°、45°、60°条件下骨、髓内钉及锁钉和整体结构进行应力分析。[结果]有限元分析(FEA)结果显示,锁钉以15°角置入时,骨、髓内钉及锁钉所受最大应力为最小,应力分布也较其它角度均匀。在0°角时,骨的最大应力较15°、30°和45°时大。随着穿钉角度的增大,近端锁钉最大应力增加,远端锁钉最大应力减小。[结论]有限接触式髓内钉减少了对骨原有生物环境的破坏,可与人工表面关节结合运用于异体骨关节移植,有较好的临床应用价值。

摘要：目的:设计、制造一种可与人工表面关节结合的有限接触式股骨髁上型带锁髓内钉,构成人工半膝关节系统,以期用于提高儿童保肢手术效果。方法:观察对象为解放军第四军医大学西京医院骨科右股骨下段骨肉瘤术后复发患儿,男,14岁,2001-03因右股骨下段骨肉瘤在外院行瘤段灭活再植保肢手术。2002-02因再次复发入院。设计有限接触式股骨髁上型带锁髓内钉,患肢经螺旋CT扫描获取数据后,瘤段切除,定制化人工半膝关节复合大段同种异体骨修复股骨下段骨缺损。术后观察人工关节面、髓内钉有无变形断裂、与异体骨及宿主骨的固定效果P关节的稳定性,功能情况。肿瘤复发截肢后,对围绕髓内钉的新生组织行放射影像、形态学、组织学观察,并四环素荧光标记。结果:①人工关节面、髓内钉无变形,松动和断裂,关节间隙始终存在,内固定确定可靠。②沿髓内钉纵向走行的新生组织证实为新骨,命名“内生环钉骨痂”。③定制化人工半膝关节可以改善异体半关节移植患者的膝关节功能。结论:有限接触式髓内钉减少了对骨原有生物环境的破坏,可与人工表面关节结合运用于异体骨关节移植。