摘要：目的构建大鼠趋化因子CX3C的配体1(chemokine CX3C ligand 1,CX3CL1)基因慢病毒RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,观测其沉默CX3CL1基因对骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,b MSCs)生长及其趋化效应的影响。方法首先分离、培养大鼠骨髓b MSCs,并予以流式细胞术检测鉴定。针对CX3CL1基因mRNA序列,筛选3个小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)靶点并予以合成。把合成的siRNA导入b MSCs,Western blot检测其对靶基因编码蛋白的抑制效应,以此明确最佳siRNA。设计与合成针对最佳siRNA序列的短发夹RNA(short hair RNA,shRNA),连入CD513B-1慢病毒载体,构建CD513B-1/CX3CL1 shRNA慢病毒,并行测序鉴定。测序正确者用293T细胞包装成具有高效感染力的CD513B-1/CX3CL1 shRNA重组慢病毒,该重组病毒用于感染b MSCs。分离培养大鼠脾巨噬细胞,将其与被感染的b MSCs共培养。倒置显微镜下观测被感染b MSCs的绿色荧光蛋白(GFP)的表达情况;CCK-8检测被感染b MSCs的生长变化;Real-time PCR检测被感染b MSCs的CX3CL1与核抗原PCNA基因的表达变化;Western blot检测被感染b MSCs的CX3CL1和PCNA蛋白,与被感染的b MSCs共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF和IL-8的表达变化。结果大鼠b MSCs得以分离、培养和鉴定。筛检得CX3CL1基因的最佳干扰序列:CTCTATGAGCAATTATTTA;测序证实,成功构建重组慢病毒载体CD513B-1/CX3CL1 shRNA。荧光观察表明,被CD513B-1/CX3CL1shRNA病毒感染的b MSCs明显表达GFP。CCK-8检测结果显示,与对照细胞比较,沉默CX3CL1的b MSCs的生长减慢,48 h开始更为明显(P<0.01);Real-time PCR、Western blot检测结果证实,CX3CL1基因的shRNA慢病毒能有效沉默b MSCs的CX3CL1,并下调其核抗原基因PCNA及其蛋白的表达,沉默CX3CL1的b MSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达。结论成功构建CX3CL1基因RNAi重组慢病毒载体。该病毒载体能有效沉默b MSCs的CX3CL1基因,使b MSCs的生长减慢并下调其核抗原PCNA基因及其编码蛋白的表达。沉默CX3CL1的b MSCs能下调与其共培养的脾巨噬细胞的趋化因子M-CSF、IL-8的表达。