摘要：设计合成针对丙型肝炎病毒 (HCV )核心区基因 (第3 84— 3 86nt)的锤头状核酶 (Ribozyme ,Rz) ,从丙型肝炎病人的血清中提取HCV　RNA ,经RT—PCR扩增HCV基因片段( 4 12bp) ,作为核酶的靶序列 ,将核酶基因和HCV靶基因片段分别克隆人反转录病毒载体 pLXN中构建重组载体 ,并用电击法分别转入包装细胞PA3 17中 ,将上述两种转细胞释放到培养液中的含Rz的假病毒颗粒和含HCV靶基因的假病毒颗粒混合后 ,共同感染空白的PA3 17细胞 ,被感染细胞维持液的RT -PCR结果表明 ,无HCV靶基因产物即无靶基因的假病毒颗粒释放至维持液中 ,证明Rz在细胞内有切割HCV靶RNA的活性。

摘要：目的建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)α链可变区(Vα)基因的方法。方法根据TCR Vα32个亚家族的基因序列特点,设计扩增Vα基因的上游内、外引物各42条,并将上游内、外引物各分为5组简并引物。在恒定区(C区)设计下游内、外引物,测序引物以及扩增Cα基因的上游引物各1条。提取细胞RNA,用PolyA介导反转录后,采用巢式PCR扩增正常人外周血单个核细胞(PBMC)中CD8 T细胞TCR Vα的32个亚家族基因,以Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用T-easy载体克隆RT-PCR产物,对克隆基因进行测序分析。结果从正常人CD8 T细胞中扩增到了所有TCR Vα亚家族基因,以10个Jurkat细胞所提取的RNA作为模板即可获得成功扩增。TCR Vα同一亚家族基因的同源性均大于75%,序列差异主要在CDR3高变区。结论建立了一种高效灵敏的TCR Vα编码基因扩增方法,为抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

摘要：目的鉴定分析microRNA(miRNA)miR-181a在转染了乙型肝炎病毒(HBV)基因组的HepG2.2.15细胞中的表达情况,探讨miR-181a在与HBV相关的肝脏疾病中的作用。方法以本课题组基因芯片结果为基础,设计并合成miR-181a探针,采用Northernblotting检测miR-181a在HepG2.2.15和HepG2细胞(对照组)中的表达水平,应用生物信息学方法结合mRNA表达谱芯片结果预测miR-181a的靶基因,选取靶基因HLA-A2,应用流式细胞仪分析HLA-A2分子在上述2种细胞中的表达。结果Northernblotting结果显示,与对照组相比,miR-181a在HepG2.2.15细胞中的表达量显著增高;miR-181a可能的靶基因包括C8A、IDH1和HLA-A等,miR-181a可能通过其种子序列与其靶基因HLA-A的3′-UTR区部分互补结合来调节HLA-A的表达;流式分析也显示HLA-A2分子在HepG2.2.15细胞中的表达量(43.9%)显著低于HepG2细胞(96.6%)。结论miR-181a在HBV转染的HepG2.2.15细胞中高表达,并可能下调靶基因HLA-A的表达,推测这可能是HBV感染后病毒逃避免疫反应、持续复制的机制之一。

摘要：目的研究中国人群中流行的乙型肝炎病毒(HBV)基因型B型和C型特异性CTL表位的序列特点。方法以国外文献报道的13个HBV的CTL表位氨基酸序列为参考序列,分析其与GenBank下载的45条及作者从乙型肝炎病人血清中扩增的另外5条B型或C型CTL表位氨基酸序列的差别。结果与参考序列相比,本研究分析的B型和C型HBV特异性CTL表位氨基酸序列变异发生频率较高。在本研究分析的13个表位中,变异发生率超过70%的表位在B型HBV有4个,分别是表位FLLTRILTI(A0201,S183-191)、VLQAGFFLL(A0201,S188-196)、ILSPFLPLL(A0201,S382-390)和FLPSDFFPSV(A0201,C18-27),C型HBV有2个,分别是表位ILSPFLPLL(A0201,S382-390)和FLPSDFFPSV(A0201,C18-27)。其中文献中研究最多的HBcAg表位18-27(FLPSDFFPSV),在我国流行的B型和C型HBV中表位的变异率分别高达71%和97%。结论中国人群流行的B型和C型HBV特异性CTL表位与国外文献报道的CTL表位相比在大多数位点上都出现变异,并且不同表位的变异率差异很大,在检测CTL数量和功能时应根据这一特点设计实验。

摘要：目的:筛选能被β干扰素反式调节的靶基因,研究β干扰素的生物学功能及其机制。方法:设计并合成β干扰素(IFNβ)特异性引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增IFNβ基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的IFNβ编码基因片段克隆到TA载体中,进行测序鉴定后构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-IFN-β。以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,转染HepG2细胞,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA。应用基因表达谱芯片技术对差异表达的mRNA进行检测和分析。结果:HepG2细胞经转染IFN-β之后,有70条差异基因表达,其中40条基因表达增强,30条基因表达降低。这些差异表达基因与细胞的增生、分化和细胞的信号转导密切相关。结论:应用基因表达谱芯片技术筛选到IFN-β的反式调节基因,为进一步探索IFN-β可能的调节机制及其生物学功能提供了新的依据。

摘要：目的建立慢性乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的滚环扩增(RCA)方法。方法以27例慢性乙型肝炎患者的肝组织cccDNA和血清松弛环状DNA(rcDNA)为研究对象。根据中国患者HBV基因序列特点设计4对引物,分别可与HBVcccDNA的正、负链结合。在Phi29DNA聚合酶的作用下,获得线性多拷贝cccDNA扩增产物,以该产物为模板获得cccDNA全序列;通过对模板的系列稀释鉴定RCA方法的灵敏度;以RCA产物为模板扩增肝组织cccDNA的反转录酶区基因,并与同时扩增的同时间采集的同一患者血清中的rcDNA序列进行比较。结果成功建立了HBVcccDNA全序列的RCA方法,最低可检测到10个拷贝的cccDNA分子,并获得了所有扩增cccDNA的全基因序列。27例患者中,18例患者的肝组织cccDNA和血清rcDNA反转录酶区的序列完全一致,9例患者中共检出84个不同的核苷酸位点,平均每个患者9.3个,84个不同核苷酸中只有5个引起了氨基酸的改变。结论滚环扩增方法对肝组织HBVcccDNA的检测具有较好的灵敏度。该方法的建立对深入了解cccDNA在HBV致病机制中的作用以及评价抗病毒疗效有重要意义。

摘要：目的:应用基因芯片技术,对乙型肝炎病毒DNA(HBVDNA)聚合酶P结构域蛋白/逆转录酶(PR)的基因表达谱进行分析,探索PR对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法:设计并合成PR基因序列特异性的引物,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增PR蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术将获得的PR编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定,构建真核表达载体pcDNA3. 1(-) PR。以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3. 1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析。结果:基因芯片技术所检测的1 152个基因表达谱的筛选中, 79条基因表达水平上调, 90条基因表达水平下调。结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了HBVDNA聚合酶PR转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明PR蛋白可能的分子生物学机制提供依据。

摘要：目的对来源于我国不同地区的150例慢性丙型肝炎患者进行HCV基因分型和NS3蛋白激酶编码区序列分析。方法基因分型采用基因芯片法;NS3区序列扩增采用自行设计的型特异性引物介导巢式RT-PCR,序列分析采用PCR产物直接测序。结果 150例患者HCV基因分型结果为1b占66.7%(100/150),2a占22.7%(34/150),3a占4%(6/150),3b占4%(6/150),6型占2%(3/150),1a占0.7%(1/150)。对NS3区序列采用进化树分析进行分型,其结果与基因芯片法分型结果高度一致,主要基因型(1a、2b)的NS3区序列无明显地区性聚集倾向。未检出与新型HCV蛋白酶抑制剂telaprevir耐药相关的V36M/A、T54A、R155K/T和A/156V/T变异。结论我国慢性丙型肝炎患者仍以1b型感染为主,采用NS3蛋白酶编码区序列分析可同时进行基因分型和针对蛋白酶抑制剂的耐药变异检测,我国天然存在的相对优势变异株发生telaprevir原发耐药的可能性很小。

摘要：目的对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4A(NS4A)反式激活靶基因1(NS4ATP1)进行生物信息学分析,并进行原核表达。方法应用生物信息学方法对NS4ATP1基因编码产物进行分析。设计并合成序列特异性引物,聚合酶链反应(PCR)扩增NS4ATP1基因,产物克隆入原核表达载体pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),以0.1 mol/L IPTG诱导,SDS-PAGE和West-ern Blot方法检测NS4ATP1在原核细胞中的表达。结果NS4ATP1定位于染色体3q12.2,其氨基酸含有3个N端糖基化位点、8个蛋白激酶C磷酸化位点、9个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和4个N端酰基化位点。利用pET32a(+)原核表达载体和相应的BL21(DE3)菌株,在体外成功表达了57.0 kDa的NS4ATP1与His标签的融合蛋白。结论生物信息学技术可以全面分析新基因NS4ATP1的染色体定位及潜在的功能位点。新基因NS4ATP1在大肠杆菌中成功表达,为进一步研究其生物学功能提供平台。

摘要：目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用新的靶基因,利用基因芯片技术(DNA chips)对于表达和不表达HBxAg的hepG2细胞的基因表达谱进行比较,以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明HBxAg的反式激活作用分子生物学机制,以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以含有2拷贝头尾连接的HBV DNA的质粒pCP10作为模板,根据ayw亚型的HBV DNA序列设计、合成引物,PCR扩增产物克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-)中,转染肝母细胞瘤细胞系hepG2,提取RNA并进行逆转录.进行基因芯片技术分析.以生物信息学技术,克隆、鉴定新基因.结果:在16种HBxAg上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为1 206个核苷酸(nt),编码产物由401个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP10.结论HBxAg是一种具有反式激活作用的蛋白.基因芯片技术是进行基因表达谱分析的可靠、有效技术.分子克隆技术结合生物信息学技术,是目前鉴定、克隆未知功能新基因的有效技术途径.