摘要：目的:10-23型脱氧核酶是脱氧核糖核酸酶中的一种,能主动在RNA分子嘌呤-嘧啶结合点切割所有RNA分子,通过比较反义寡核苷酸的作用,初步研究10-23型脱氧核酶对基因表达抑制作用的发生机制。方法:采用体外转录GFP mRNA与脱氧核酶反应,以及GFP表达质粒与脱氧核酶共转染HeLa细胞,观察脱氧核酶对GFP的抑制作用。结果:体外和胞内实验均显示据靶点设计的10-23型脱氧核酶对绿色荧光蛋白mRNA具有切割作用。当10-23型脱氧核酶的两翼结合臂各具有连续8碱基互补而处在两翼结合臂和酶解核心连接处的2碱基错配时,尽管不能切割mRNA但是在胞内仍然有表达抑制作用;而当两翼结合臂具有4互补碱基紧接1错配碱基和4互补碱基时,10-23型脱氧核酶体外和胞内均丧失作用。结论:10-23型脱氧核酶对基因较强的表达抑制作用来自结合臂的反义寡核苷酸依赖的RNase H降解,和本身对mRNA直接切割作用的叠加,即10-23型脱氧核酶在细胞内具有对基因识别切割和诱导RNase H进行再切割的双重作用。

摘要：基因mRNA的靶点筛选是设计反义寡核苷酸的关键.建立了PARASS(polyAanchoredRNAaccessiblesitesscreening)方法,即通过在mRNA末端引入polyA,与生物素标记的polyT退火结合,将其同链亲和素磁珠混合,使mRNA通过3’末端得到固定,保持mRNA的自然伸展和折叠,与寡核苷酸文库杂交筛选mRNA的结合靶点.PARASS筛选获得了绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的3个反义寡核苷酸结合靶点,据其设计了多条反义寡核苷酸,与对照组相比,体外RNaseH分析显示3个靶点均为有效,在HeLa细胞内针对靶点的反义寡核苷酸能抑制GFP的表达,得到了Northern印迹结果支持.PARASS对反义寡核苷酸药物设计具有应用价值.