摘要：目的克隆表达白纹伊蚊唾液腺34ku-1蛋白(Aalb_34 ku-1),并制备鼠抗34ku-1多克隆抗体,用于蚊唾液34ku-1蛋白的检测。方法根据白纹伊蚊罗马株(GenBank:AY826117.1)34ku去除信号肽后的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊安顺株雌蚊体内扩增获得34ku-1基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)等对该蛋白进行生物信息学分析。将该基因构建到原核表达质粒pET-32a(+)中,转染大肠埃希菌BL21(DE3)后经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析表达结果。镍柱纯化34ku-1重组蛋白,采用Western blot验证纯化蛋白的免疫反应性。用纯化的34ku-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,采用间接ELISA法检测血清抗体效价,采用Western blot方法对抗体的特异性进行鉴定。收集雌蚊唾液,采用Western blot方法用制备的多克隆抗体检测蚊唾液34ku-1蛋白。结果成功克隆获得34ku-1基因,生物信息学分析该基因全长888 bp,编码295个氨基酸。编码蛋白的理论分子质量单位为33.6 ku,等电点为5.54。重组质粒pET-32a(+)-34ku-1经PCR、双酶切及测序验证构建正确。经IPTG诱导的BL21重组菌表达产物主要以包涵体形式存在。经亲和层析法获得高纯度的34ku-1重组蛋白,浓度为0.71 mg/mL。Western blot显示重组蛋白可被抗6-His tag抗体识别,制备的鼠抗34ku-1血清抗体效价为1∶625000,且特异性良好,用34ku-1多克隆抗体Western blot可检测到蚊虫唾液中的34ku-1蛋白。结论成功克隆并表达了白纹伊蚊34ku-1原核蛋白,制备了高效价、高特异性的鼠抗34ku-1多克隆抗体,应用该抗体可检测到雌蚊唾液中的34ku-1蛋白。

摘要：目的设计家蝇抗真菌肽MAF-1A衍生肽Mt6-21DLeu,探讨其抗白色念珠菌(Candida albicans,Ca)活性及作用机制。方法通过氨基酸替换法设计MAF-1A衍生肽Mt6-21DLeu;采用微量液体稀释法测定Mt6-21DLeu对Ca的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)以及不同环境中Mt6-21DLeu对Ca抑菌活性的变化;通过时间-杀菌曲线反映Mt6-21DLeu对Ca的杀菌动力学;通过结晶紫染色测定Mt6-21DLeu对Ca不同阶段生物被膜的清除作用;采用多功能酶标仪检测荧光探针DPH的相对荧光密度;荧光显微镜观察Mt6-21DLeu的细胞膜通透性;采用流式细胞仪检测Mt6-21DLeu影响Ca活性氧ROS生成的影响。结果与MAF-1A相比,Mt6-21DLeu抑制Ca生长的效果提高近5倍,其MIC和MFC分别为0.128 mg/ml和0.256 mg/ml。在盐离子环境中,Mt6-21DLeu活性几乎不受影响,胰酶环境对Mt6-21DLeu有所抑制但远小于对MAF-1A活性的干扰。时间-杀菌曲线结果显示在MIC和2 MIC浓度下,Mt6-21DLeu于9 h后逐渐抑制Ca的生长;4 MIC浓度时Mt6-21DLeu的杀菌能力增强。Mt6-21DLeu在4、24、48 h时均能部分清除Ca已形成的生物被膜,清除效果与Mt6-21DLeu的浓度有关;4 MIC浓度的Mt6-21DLeu能显著增加Ca细胞膜的流动性(P<0.01)及通透性,进而引起Ca菌体内ROS的积累。结论衍生肽Mt6-21DLeu能高效、持久、稳定地抑杀Ca,其抗菌作用可能通过增强细胞膜通透性、促进胞内ROS积累的多靶点模式实现。因此,可将Mt6-21DLeu作为治疗Ca感染的候选药物分子。

摘要：目的 初探白纹伊蚊唾液蛋白Antigen5-3(Alb-AG5-3)的结构与功能特征,并采用果蝇S2真核表达体系表达Alb-AG5-3。方法 采取同源比对的方式,从NCBI数据库中钓取Antigen5-3序列,根据白纹伊蚊分泌蛋白Antigen5-3基因参考序列(GenBank:AY826105.1)设计特异性引物,从白纹伊蚊安顺株中扩增基因全长。经序列比对后利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expasy)以及生物信息学在线软件SignalP、TMHMM、SOPMA、SWISS-MODEL、AlphaFold等对该蛋白进行生物信息学分析。Trizol法提取白纹伊蚊雌蚊与雄蚊整蚊以及吸血前后雌蚊唾液腺RNA,qRT-PCR检测Alb-AG5-3在RNA相对表达量;以白纹伊蚊整蚊cDNA为模板,特异性扩增除信号肽外的Alb-AG5-3编码区,PCR产物经切胶回收纯化后与昆虫真核表达载体pMT/BiP/V5连接,构建真核重组质粒pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3。随后转入果蝇S2细胞中,500μmol/L CuSO4诱导重组蛋白Alb-AG5-3的表达。收集上清,采用Western blot鉴定V5表达标签,镍柱亲和层析纯化重组蛋白Alb-AG5-3。结果 生物信息学分析该基因CDS(Coding sequence)区扩增全长为768 bp,编码255个氨基酸,二、三级结构预测以无规则卷曲和a-螺旋为主,具CAP超家族经典的PR-1结构域,该基因编码的蛋白是一种强亲水性(GRAVY:-0.864)的富含半胱氨酸的分泌蛋白。Alb-AG5-3 mRNA在雌蚊中表达量高于雄蚊且吸血后的表达量显著下调。成功构建了白纹伊蚊唾液蛋白pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3真核表达质粒并通过果蝇S2表达体系表达出真核蛋白,镍柱亲和纯化后的Alb-AG5-3经Western blot检测能被V5标签蛋白抗体识别。结论 成功构建白纹伊蚊Alb-AG5-3真核质粒并在果蝇S2细胞中表达真核蛋白Alb-AG5-3,镍柱亲和纯化后获得单一的Alb-AG5-3蛋白以备后续分析。

摘要：目的建立检测人呼吸道合胞病毒(human Respiratory Syncytial Virus, hRSV)实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)绝对定量检测法。方法提取人呼吸道合胞病毒mRNA并逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用hRSV的N基因作为目的基因设计的引物进行PCR扩增,扩增产物连接到pMDTM 18-T载体,构建标准检测质粒。以构建的标准检测质粒进行qRT-PCR,建立绝对定量检测的标准曲线。结果 PCR扩增获得714 bp产物,与pMDTM 18-T载体连接构建的标准检测质粒测序验证成功。qRT-PCR检测目的基因扩增效率E为105.2%,R^2=0.998,在1.0×10^2~1.0×10^8拷贝范围内具良好线性关系,最低检测限为100拷贝/反应。结论成功建立了hRSV qRT-PCR绝对定量检测法,该方法快速、特异、灵敏,为hRSV诊断试剂盒的研制奠定了基础。

摘要：目的 探讨驱动蛋白Kif5b对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)血管形成的作用。方法 以人Kif5b基因序列为模板设计小发夹RNA(sh RNA)序列,同时设阴性对照sh RNA,均以p LL3.7慢病毒包装系统包装sh RNA,随后感染HUVECs敲减Kif5b蛋白,最后将Kif5b敲减的HUVECs作为Kif5b实验组,阴性对照组作为Kif5b对照组;采用Western blot实验检测2组HUVECs中Kif5b的表达,采用细胞成管实验和细胞划痕实验分别检测2组HUVECs的细胞成管率和细胞迁移速度。结果 Kif5b实验组HUVECs的Kif5b表达较Kif5b对照组下降,差异有统计学意义(P<0.05);Kif5b实验组HUVECs细胞成管率明显低于Kif5b对照组,差异有高度统计学意义(P<0.000 1);Kif5b实验组HUVECs细胞迁移速度明显低于Kif5b对照组,差异有高度统计学意义(P<0.000 1)。结论 在体外实验中,驱动蛋白Kif5b能够正向调控HUVECs血管形成。