摘要：目的设计家蝇抗真菌肽MAF-1A衍生肽Mt6-21DLeu,探讨其抗白色念珠菌(Candida albicans,Ca)活性及作用机制。方法通过氨基酸替换法设计MAF-1A衍生肽Mt6-21DLeu;采用微量液体稀释法测定Mt6-21DLeu对Ca的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)以及不同环境中Mt6-21DLeu对Ca抑菌活性的变化;通过时间-杀菌曲线反映Mt6-21DLeu对Ca的杀菌动力学;通过结晶紫染色测定Mt6-21DLeu对Ca不同阶段生物被膜的清除作用;采用多功能酶标仪检测荧光探针DPH的相对荧光密度;荧光显微镜观察Mt6-21DLeu的细胞膜通透性;采用流式细胞仪检测Mt6-21DLeu影响Ca活性氧ROS生成的影响。结果与MAF-1A相比,Mt6-21DLeu抑制Ca生长的效果提高近5倍,其MIC和MFC分别为0.128 mg/ml和0.256 mg/ml。在盐离子环境中,Mt6-21DLeu活性几乎不受影响,胰酶环境对Mt6-21DLeu有所抑制但远小于对MAF-1A活性的干扰。时间-杀菌曲线结果显示在MIC和2 MIC浓度下,Mt6-21DLeu于9 h后逐渐抑制Ca的生长;4 MIC浓度时Mt6-21DLeu的杀菌能力增强。Mt6-21DLeu在4、24、48 h时均能部分清除Ca已形成的生物被膜,清除效果与Mt6-21DLeu的浓度有关;4 MIC浓度的Mt6-21DLeu能显著增加Ca细胞膜的流动性(P<0.01)及通透性,进而引起Ca菌体内ROS的积累。结论衍生肽Mt6-21DLeu能高效、持久、稳定地抑杀Ca,其抗菌作用可能通过增强细胞膜通透性、促进胞内ROS积累的多靶点模式实现。因此,可将Mt6-21DLeu作为治疗Ca感染的候选药物分子。

摘要：目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。

摘要：目的:获得高纯度Cas9蛋白,制备Cas9蛋白特异性抗体。方法:以Cas9基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得Cas9基因全长序列,利用无缝拼接技术构建pET28a-Cas9重组表达载体;转化***21(DE3),经IPTG诱导表达Cas9蛋白,并利用His-Tag技术分离纯化Cas9蛋白;将纯化获得的Cas9蛋白免疫新西兰大白兔,制备Cas9蛋白多克隆抗体。结果:pET28a-Cas9重组表达载体转化的***21(DE3)可表达Cas9蛋白,纯化的Cas9蛋白免疫家兔得到的多克隆抗体效价>1∶256 K。结论:本研究获得了高质量Cas9蛋白及多克隆抗体,为后续CRISPR-Cas9基因编辑的应用奠定了良好的基础。

摘要：目的肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体KP-ZS5的分离及鉴定。方法以18株临床分离肺炎克雷伯菌为宿主菌,采用双层平板法从水样中分离肺炎克雷伯菌噬菌体并进行纯化,透射电镜观察噬菌体形态,提取噬菌体DNA及蛋白并测定其生理生化特性。结果成功分离到1株长尾肺炎克雷伯菌噬菌体,并命名为KP-ZS5,pH稳定性实验表明KP-ZS5不耐强酸(pH≤3);限制性片段酶切多样性(RFLP)分析表明,KP-ZS5基因组中存在3个BglⅡ酶切位点,预计总基因组大小为20000~30000 bp;裂解谱实验表明,KP-ZS5可以感染33%(6/18)的临床肺炎克雷伯菌株;SDS-PAGE结果显示,在KP-ZS5外壳蛋白由3种蛋白组成,外壳蛋白分子量为35~48 kDa。结论成功分离出1株长尾肺炎克雷伯菌噬菌体KP-ZS5,该噬菌体具有较广的宿主范围和pH值耐受性,外壳蛋白组成简单,仅含3种分子量为35~48 KDa的组分,具有在临床治疗肺炎克雷伯菌感染的潜力。