摘要：目前,多数高校的医学细胞生物学实验对细胞器观察仅通过切片进行形态学观察,实验形式单一,教学效果欠佳。文章基于学科交叉理念设计了结构与功能相对应的细胞器染色和观察综合性教学实验,并招募临床、基础医学等专业学生开展开放性实验。通过将携带荧光基团的药物对细胞进行孵育,同时利用Mitotracker、Lysotracker对线粒体和溶酶体进行特异性荧光染色,观察药物进入细胞器的动态过程。利用线上线下混合式教学,通过课前学习、课中指导、课后培养三个阶段,打造以学生自学为主、教师指导为辅的多学科交叉的实验教学课程,弥补传统实验课程内容单一、学术创新思维培养不够等特点。课程改革旨在提高学生自主学习能力及科研实验技能,通过学科交叉帮助学生深入理解细胞器的功能,为学生将来的科研学习奠定扎实的基础。

摘要：目的克隆表达白纹伊蚊唾液腺34ku-1蛋白(Aalb_34 ku-1),并制备鼠抗34ku-1多克隆抗体,用于蚊唾液34ku-1蛋白的检测。方法根据白纹伊蚊罗马株(GenBank:AY826117.1)34ku去除信号肽后的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊安顺株雌蚊体内扩增获得34ku-1基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)等对该蛋白进行生物信息学分析。将该基因构建到原核表达质粒pET-32a(+)中,转染大肠埃希菌BL21(DE3)后经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析表达结果。镍柱纯化34ku-1重组蛋白,采用Western blot验证纯化蛋白的免疫反应性。用纯化的34ku-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,采用间接ELISA法检测血清抗体效价,采用Western blot方法对抗体的特异性进行鉴定。收集雌蚊唾液,采用Western blot方法用制备的多克隆抗体检测蚊唾液34ku-1蛋白。结果成功克隆获得34ku-1基因,生物信息学分析该基因全长888 bp,编码295个氨基酸。编码蛋白的理论分子质量单位为33.6 ku,等电点为5.54。重组质粒pET-32a(+)-34ku-1经PCR、双酶切及测序验证构建正确。经IPTG诱导的BL21重组菌表达产物主要以包涵体形式存在。经亲和层析法获得高纯度的34ku-1重组蛋白,浓度为0.71 mg/mL。Western blot显示重组蛋白可被抗6-His tag抗体识别,制备的鼠抗34ku-1血清抗体效价为1∶625000,且特异性良好,用34ku-1多克隆抗体Western blot可检测到蚊虫唾液中的34ku-1蛋白。结论成功克隆并表达了白纹伊蚊34ku-1原核蛋白,制备了高效价、高特异性的鼠抗34ku-1多克隆抗体,应用该抗体可检测到雌蚊唾液中的34ku-1蛋白。

摘要：目的 初探白纹伊蚊唾液蛋白Antigen5-3(Alb-AG5-3)的结构与功能特征,并采用果蝇S2真核表达体系表达Alb-AG5-3。方法 采取同源比对的方式,从NCBI数据库中钓取Antigen5-3序列,根据白纹伊蚊分泌蛋白Antigen5-3基因参考序列(GenBank:AY826105.1)设计特异性引物,从白纹伊蚊安顺株中扩增基因全长。经序列比对后利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expasy)以及生物信息学在线软件SignalP、TMHMM、SOPMA、SWISS-MODEL、AlphaFold等对该蛋白进行生物信息学分析。Trizol法提取白纹伊蚊雌蚊与雄蚊整蚊以及吸血前后雌蚊唾液腺RNA,qRT-PCR检测Alb-AG5-3在RNA相对表达量;以白纹伊蚊整蚊cDNA为模板,特异性扩增除信号肽外的Alb-AG5-3编码区,PCR产物经切胶回收纯化后与昆虫真核表达载体pMT/BiP/V5连接,构建真核重组质粒pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3。随后转入果蝇S2细胞中,500μmol/L CuSO4诱导重组蛋白Alb-AG5-3的表达。收集上清,采用Western blot鉴定V5表达标签,镍柱亲和层析纯化重组蛋白Alb-AG5-3。结果 生物信息学分析该基因CDS(Coding sequence)区扩增全长为768 bp,编码255个氨基酸,二、三级结构预测以无规则卷曲和a-螺旋为主,具CAP超家族经典的PR-1结构域,该基因编码的蛋白是一种强亲水性(GRAVY:-0.864)的富含半胱氨酸的分泌蛋白。Alb-AG5-3 mRNA在雌蚊中表达量高于雄蚊且吸血后的表达量显著下调。成功构建了白纹伊蚊唾液蛋白pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3真核表达质粒并通过果蝇S2表达体系表达出真核蛋白,镍柱亲和纯化后的Alb-AG5-3经Western blot检测能被V5标签蛋白抗体识别。结论 成功构建白纹伊蚊Alb-AG5-3真核质粒并在果蝇S2细胞中表达真核蛋白Alb-AG5-3,镍柱亲和纯化后获得单一的Alb-AG5-3蛋白以备后续分析。

摘要：探讨Aalb_56 ku基因在白纹伊蚊(广州株)不同组织中的表达差异;对唾液腺中Aalb_56 ku基因进行克隆表达并探索其免疫原性。采用实时荧光定量RT-PCR法对雌蚊中肠、脂肪体、唾液腺不同组织中Aalb_56 ku基因的表达差异进行分析。针对Aalb_56 ku基因序列设计特异性引物,以唾液腺RNA为模板获得56 ku全长基因序列,构建重组质粒并测序,将测序序列进行生物信息学和抗原表位预测分析。IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白;制备小鼠特异性抗Aalb_56 ku蛋白抗血清。结果显示,Aalb_56 ku在白纹伊蚊(广州株)唾液腺(SG)中高表达。克隆所获唾液腺56 ku基因全长1 593 bp,可编码530个氨基酸,信息学分析提示该基因含有信号肽序列,等电点为8.40,抗原表位预测提示含有23个表位。p ET30a(+)-56 ku重组质粒可表达约56 k Da大小的融合蛋白,且呈包涵体形式表达,Western blotting鉴定具有His标签。纯化蛋白免疫Balb/c小鼠后可获得1∶100效价的特异性抗血清,提示该重组蛋白具有一定的免疫原性。

摘要：目的设计家蝇抗真菌肽MAF-1A衍生肽Mt6-21DLeu,探讨其抗白色念珠菌(Candida albicans,Ca)活性及作用机制。方法通过氨基酸替换法设计MAF-1A衍生肽Mt6-21DLeu;采用微量液体稀释法测定Mt6-21DLeu对Ca的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)以及不同环境中Mt6-21DLeu对Ca抑菌活性的变化;通过时间-杀菌曲线反映Mt6-21DLeu对Ca的杀菌动力学;通过结晶紫染色测定Mt6-21DLeu对Ca不同阶段生物被膜的清除作用;采用多功能酶标仪检测荧光探针DPH的相对荧光密度;荧光显微镜观察Mt6-21DLeu的细胞膜通透性;采用流式细胞仪检测Mt6-21DLeu影响Ca活性氧ROS生成的影响。结果与MAF-1A相比,Mt6-21DLeu抑制Ca生长的效果提高近5倍,其MIC和MFC分别为0.128 mg/ml和0.256 mg/ml。在盐离子环境中,Mt6-21DLeu活性几乎不受影响,胰酶环境对Mt6-21DLeu有所抑制但远小于对MAF-1A活性的干扰。时间-杀菌曲线结果显示在MIC和2 MIC浓度下,Mt6-21DLeu于9 h后逐渐抑制Ca的生长;4 MIC浓度时Mt6-21DLeu的杀菌能力增强。Mt6-21DLeu在4、24、48 h时均能部分清除Ca已形成的生物被膜,清除效果与Mt6-21DLeu的浓度有关;4 MIC浓度的Mt6-21DLeu能显著增加Ca细胞膜的流动性(P<0.01)及通透性,进而引起Ca菌体内ROS的积累。结论衍生肽Mt6-21DLeu能高效、持久、稳定地抑杀Ca,其抗菌作用可能通过增强细胞膜通透性、促进胞内ROS积累的多靶点模式实现。因此,可将Mt6-21DLeu作为治疗Ca感染的候选药物分子。

摘要：目的建立一种针对登革2型病毒(DENV-2)的快速、灵敏、特异的检测方法。方法从Gen Bank下载105株DENV-2病毒毒株全基因序列,应用生物软件Bioedit进行比对分析筛选出保守序列,在保守区域设计特异引物和探针,建立检测DENV-2的TaqMan荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法。结果该方法检测灵敏度达到102copies/μL;特异性验证中除登革2型病毒有明显扩增外,与墨累谷脑炎病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒、登革病毒1、3、4型、黄热病毒和科萨努尔森林病毒、乙型脑炎病毒均无交叉反应。重复性实验结果表明该方法的组间和组内的变异系数(CV)均<2%。对人工感染DENV-2的87只蚊虫标本进行比对实验,结果荧光定量RT-PCR检测出56份阳性,传统RT-PCR只检测出16份阳性,差异有统计学意义(χ~2=37.908,P=0.000)。结论 TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测DENV-2,特异性强、敏感性高。

摘要：目的:探讨等温链置换扩增结合纳米金测流层析试纸条用于登革热病毒(DENV)快速检测的可行性。方法:采用磁珠富集法提取病毒总RNA,并逆转录为cDNA用于等温链置换扩增检测体系;等温链置换扩增用于检测DENV,琼脂糖凝胶电泳用于分析等温链置换扩增产物及其检测的敏感度;采用柠檬酸三钠还原法制备用于试纸条的纳米金颗粒;利用核酸碱基互补配对原理设计纳米金测流层析试纸条的检测线与控制线,建立DENV的检测体系。结果:等温链置换扩增的敏感度为10 fmol/L。基于等温链置换扩增的纳米金测流层析试纸条检测DENV的敏感度也为10 fmol/L,取其检测样品浓度的对数值进行线性分析,检测浓度范围为10～10^(12)fmol/L,符合线性回归方程,线性相关系数(R^2)为0. 98。基于等温链置换扩增的纳米金测流层析试纸条检测DENV的特异性较高,与其他对照组无交叉。结论:建立了基于等温链置换扩增反应的纳米金试纸条用于DENV的检测方法,检测结果肉眼可见,敏感度高,可用于DENV的快速检测。

摘要：目的评估线粒体分裂蛋白1(Fis1)在甲基苯丙胺(METH)诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)损伤中的作用。方法采用成组设计方法,将体外培养SH-SY5Y细胞分为不同组别:未沉默组、沉默阴性组和沉默组,不同浓度的METH诱导各组SH-SY5Y细胞24 h。利用Western blot检测Fis1蛋白表达水平,使用CCK-8细胞毒性增殖实验分析METH对SH-SY5Y细胞增殖能力的影响,利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测METH对SH-SY5Y细胞MMP水平的影响,使用透射电镜观察METH对SH-SY5Y细胞线粒体超微结构的影响。结果未沉默组、沉默阴性组和沉默组中,与对照组比较,各组组内随METH诱导SH-SY5Y细胞的浓度升高,Fis1蛋白表达水平升高(P<0.05)、增殖能力减弱(P<0.05)、MMP水平降低(P<0.05);与未沉默组和沉默阴性组相同浓度比较,沉默组SH-SY5Y细胞Fis1蛋白表达水平降低(P<0.05),增殖能力增强(P<0.05),MMP水平升高(P<0.05)。组内与对照组比较,2.0mmol·L^-1 METH诱导未沉默组、沉默阴性组和沉默组,透射电镜观察见线粒体小球状结构增多(P<0.01)。结论Fis1可能在METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞损伤中起关键作用。

摘要：目的建立检测人呼吸道合胞病毒(human Respiratory Syncytial Virus, hRSV)实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)绝对定量检测法。方法提取人呼吸道合胞病毒mRNA并逆转录为cDNA,以cDNA为模板,用hRSV的N基因作为目的基因设计的引物进行PCR扩增,扩增产物连接到pMDTM 18-T载体,构建标准检测质粒。以构建的标准检测质粒进行qRT-PCR,建立绝对定量检测的标准曲线。结果 PCR扩增获得714 bp产物,与pMDTM 18-T载体连接构建的标准检测质粒测序验证成功。qRT-PCR检测目的基因扩增效率E为105.2%,R^2=0.998,在1.0×10^2~1.0×10^8拷贝范围内具良好线性关系,最低检测限为100拷贝/反应。结论成功建立了hRSV qRT-PCR绝对定量检测法,该方法快速、特异、灵敏,为hRSV诊断试剂盒的研制奠定了基础。

摘要：目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。