摘要：探讨Aalb_56 ku基因在白纹伊蚊(广州株)不同组织中的表达差异;对唾液腺中Aalb_56 ku基因进行克隆表达并探索其免疫原性。采用实时荧光定量RT-PCR法对雌蚊中肠、脂肪体、唾液腺不同组织中Aalb_56 ku基因的表达差异进行分析。针对Aalb_56 ku基因序列设计特异性引物,以唾液腺RNA为模板获得56 ku全长基因序列,构建重组质粒并测序,将测序序列进行生物信息学和抗原表位预测分析。IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白;制备小鼠特异性抗Aalb_56 ku蛋白抗血清。结果显示,Aalb_56 ku在白纹伊蚊(广州株)唾液腺(SG)中高表达。克隆所获唾液腺56 ku基因全长1 593 bp,可编码530个氨基酸,信息学分析提示该基因含有信号肽序列,等电点为8.40,抗原表位预测提示含有23个表位。p ET30a(+)-56 ku重组质粒可表达约56 k Da大小的融合蛋白,且呈包涵体形式表达,Western blotting鉴定具有His标签。纯化蛋白免疫Balb/c小鼠后可获得1∶100效价的特异性抗血清,提示该重组蛋白具有一定的免疫原性。

摘要：几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类,在昆虫整个生长发育过程中发挥着重要作用.为筛选及挖掘与防治有害医学昆虫相关的分子靶标,根据家蝇几丁质酶2(Musca domestica chitinase 2,MdCht2)基因序列设计并合成双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA),采用微量注射法向家蝇2龄幼虫导入dsRNA,对对照组及干扰组的样本进行转录组测序,筛选差异表达基因,进行GO(gene ontology)功能注释和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析.结果显示,注射dsRNA 24 h后,幼虫MdCht2 mRNA的表达显著下降,提示导入的dsRNA干扰了MdCht2的表达.经转录组测序,与对照组相比,显著差异基因共213条,其中78条基因为上调表达,135条基因为下调表达.随机选取8条显著差异基因通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进行验证,该结果与转录组结果趋势一致.根据功能注释发现这些差异基因与生长发育、脂类代谢、免疫调控等途径相关.本研究通过RNA干扰和转录组测序技术处理家蝇获得大量差异基因,结果可为后续几丁质酶相关基因的挖掘和鉴定及功能研究提供一定的数据基础.(图7表4参46)

摘要：目的克隆表达白纹伊蚊唾液腺34ku-1蛋白(Aalb_34 ku-1),并制备鼠抗34ku-1多克隆抗体,用于蚊唾液34ku-1蛋白的检测。方法根据白纹伊蚊罗马株(GenBank:AY826117.1)34ku去除信号肽后的基因序列设计特异性引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊安顺株雌蚊体内扩增获得34ku-1基因。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)、瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASy)等对该蛋白进行生物信息学分析。将该基因构建到原核表达质粒pET-32a(+)中,转染大肠埃希菌BL21(DE3)后经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析表达结果。镍柱纯化34ku-1重组蛋白,采用Western blot验证纯化蛋白的免疫反应性。用纯化的34ku-1重组蛋白免疫BALB/c小鼠,制备免疫血清,采用间接ELISA法检测血清抗体效价,采用Western blot方法对抗体的特异性进行鉴定。收集雌蚊唾液,采用Western blot方法用制备的多克隆抗体检测蚊唾液34ku-1蛋白。结果成功克隆获得34ku-1基因,生物信息学分析该基因全长888 bp,编码295个氨基酸。编码蛋白的理论分子质量单位为33.6 ku,等电点为5.54。重组质粒pET-32a(+)-34ku-1经PCR、双酶切及测序验证构建正确。经IPTG诱导的BL21重组菌表达产物主要以包涵体形式存在。经亲和层析法获得高纯度的34ku-1重组蛋白,浓度为0.71 mg/mL。Western blot显示重组蛋白可被抗6-His tag抗体识别,制备的鼠抗34ku-1血清抗体效价为1∶625000,且特异性良好,用34ku-1多克隆抗体Western blot可检测到蚊虫唾液中的34ku-1蛋白。结论成功克隆并表达了白纹伊蚊34ku-1原核蛋白,制备了高效价、高特异性的鼠抗34ku-1多克隆抗体,应用该抗体可检测到雌蚊唾液中的34ku-1蛋白。

摘要：结合不同抗菌肽的优点与抗菌肽Cec4杂合,以提高其抗菌能力。通过杂合肽进行序列比对、3级结构预测、相关抗菌效果等参数分析,设计出可能具有更强抗菌能力的杂合肽6条。进而采用微量稀释法,检测杂合肽对大肠杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、及各类鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。杂合肽Cec4-1-1、Cec4-4-2与母肽Cec4对革兰氏阴性菌(大肠杆菌)的抑菌效果相当,Cec4-2-1对大肠杆菌的MIC值为2μg/mL,其抑菌效果优于母肽Cec4。杂合肽和母肽Cec4对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)、真菌(白色念珠菌)均无抑菌效果。杂合肽Cec4-1-1、Cec4-2-2、Cec4-4-2与母肽Cec4对各类鲍曼不动杆菌的抑菌效果相当,Cec4-2-1对标准鲍曼不动杆菌的MIC值为0.5μg/mL,其抑菌效果优于母肽Cec4。综上,杂合肽Cec4-1-1、Cec4-2-1、Cec4-2-2、Cec4-4-2对各类鲍曼不动杆菌均有较强抑菌活性且对人红细胞无溶血反应。

摘要：目的 初探白纹伊蚊唾液蛋白Antigen5-3(Alb-AG5-3)的结构与功能特征,并采用果蝇S2真核表达体系表达Alb-AG5-3。方法 采取同源比对的方式,从NCBI数据库中钓取Antigen5-3序列,根据白纹伊蚊分泌蛋白Antigen5-3基因参考序列(GenBank:AY826105.1)设计特异性引物,从白纹伊蚊安顺株中扩增基因全长。经序列比对后利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(Expasy)以及生物信息学在线软件SignalP、TMHMM、SOPMA、SWISS-MODEL、AlphaFold等对该蛋白进行生物信息学分析。Trizol法提取白纹伊蚊雌蚊与雄蚊整蚊以及吸血前后雌蚊唾液腺RNA,qRT-PCR检测Alb-AG5-3在RNA相对表达量;以白纹伊蚊整蚊cDNA为模板,特异性扩增除信号肽外的Alb-AG5-3编码区,PCR产物经切胶回收纯化后与昆虫真核表达载体pMT/BiP/V5连接,构建真核重组质粒pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3。随后转入果蝇S2细胞中,500μmol/L CuSO4诱导重组蛋白Alb-AG5-3的表达。收集上清,采用Western blot鉴定V5表达标签,镍柱亲和层析纯化重组蛋白Alb-AG5-3。结果 生物信息学分析该基因CDS(Coding sequence)区扩增全长为768 bp,编码255个氨基酸,二、三级结构预测以无规则卷曲和a-螺旋为主,具CAP超家族经典的PR-1结构域,该基因编码的蛋白是一种强亲水性(GRAVY:-0.864)的富含半胱氨酸的分泌蛋白。Alb-AG5-3 mRNA在雌蚊中表达量高于雄蚊且吸血后的表达量显著下调。成功构建了白纹伊蚊唾液蛋白pMT/BiP/V5-Alb-AG5-3真核表达质粒并通过果蝇S2表达体系表达出真核蛋白,镍柱亲和纯化后的Alb-AG5-3经Western blot检测能被V5标签蛋白抗体识别。结论 成功构建白纹伊蚊Alb-AG5-3真核质粒并在果蝇S2细胞中表达真核蛋白Alb-AG5-3,镍柱亲和纯化后获得单一的Alb-AG5-3蛋白以备后续分析。

摘要：几丁质酶是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。本研究旨在利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统获得高纯度的MDCht2重组蛋白,并从几丁质酶活性及抗菌活性两方面来初步探讨MDCht2的生物学功能。MDCht2的cDNA序列设计包含酶切位点Eco RⅠ、HindⅢ和6×His标签的引物,以家蝇3龄幼虫的cDNA为模板进行PCR扩增,以pET28a(+)为载体构建重组质粒,并转化到大肠杆菌Transetta (DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定,利用Ni离子亲和层析技术纯化MDCht2重组蛋白,Western Blot技术及质谱分析鉴定纯化蛋白。以4MU-(GlcNAc)3为底物,测定重组蛋白的酶活性;采用微量液体稀释法分析重组蛋白对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白假丝酵母菌的抗菌活性。成功克隆MDCht2基因,构建了具有正确序列的原核重组表达质粒,将重组质粒导入Transetta(DE3)中,经镍柱纯化获得带His标签的重组MDCht2蛋白,质谱分析显示重组蛋白与MDCht2蛋白序列一致。酶活分析表明,不同浓度的MDCht2重组酶均有几丁质酶活性,呈现一定的量效关系;该重组蛋白的最适pH值为4.0,在pH=8.0时稳定性最好;最适温度为35℃;金属离子和Tris对MDCht2酶活均有抑制作用。抗菌活性结果显示,MDCht2蛋白对金黄色葡萄球菌,大肠杆菌均无抑菌效果,但对白假丝酵母菌有抑制作用,MIC值为225μg/m L,MBC(Minimum bactericidal concentration)值为450μg/mL。本研究成功获得了MDCht 2重组蛋白,体外检测有较强的几丁质酶活性和抗真菌活性,为进一步研究该酶的功能奠定一定基础。

摘要：埃及伊蚊serpin23(丝氨酸蛋白抑制剂23)在雌蚊唾液腺特异高表达,是蚊虫唾液组分的主要蛋白之一。本文设计特异性引物序列,采用RT-PCR技术扩增获得埃及伊蚊广东电白株serpin23成熟肽序列,构建重组表达质粒pET-28a(+)-serpin23并测序验证。经IPTG诱导表达、KCl染色、切胶纯化获取了目的蛋白;制备了小鼠特异性抗serpin23蛋白多克隆抗体。结果显示:获得serpin23成熟肽序列,全长1 197bp,编码399个氨基酸。等电点pI为6.13,具有serpin结构域和一个功能未知的FAINT结构域。pET-28a(+)-serpin23重组质粒可表达了大小约为47 kDa、以包涵体表达为主的融合蛋白。Western Blot结果证明serpin23重组蛋白可以与抗-His标签和抗-serpin23抗体发生免疫反应,约47 kDa处产生特异性条带。本研究成功获得了埃及伊蚊广东电白株serpin23重组表达蛋白和抗serpin23多克隆抗体,为后续功能研究奠定基础。

摘要：目的构建家蝇抗菌肽MAF-1A基因原核串联表达体系,在大肠杆菌中表达具有抗菌活性的MAF-1A。方法根据大肠杆菌密码子的偏嗜性进行密码子优化,设计并合成含有5个拷贝的MAF-1A串联基因序列;将合成的串联基因序列克隆到表达载体pET28a并转化大肠杆菌Roseeta(DE3),应用IPTG诱导表达5×MAF-1A串联重组蛋白;通过SDS-PAGE电泳、Western Blot对表达产物进行分析;用肠激酶专一性切割经Ni-NTA纯化后的5×MAF-1A重组串联蛋白,得到MAF-1A单体;采用微量稀释法检测MAF-1A单体对白念珠菌的体外抗菌活性。结果 5×MAF-1A蛋白在大肠杆菌中呈可溶性表达,28℃、0.8mmol/L IPTG诱导12h可达最大表达量;酶切后的抗菌肽MAF-1A单体对白念珠菌的MIC和MBC分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL。结论成功构建MAF-1A原核串联表达系统,重组表达的MAF-1A对白念珠菌具有较高的抑杀活性。

摘要：目的建立一种针对登革2型病毒(DENV-2)的快速、灵敏、特异的检测方法。方法从Gen Bank下载105株DENV-2病毒毒株全基因序列,应用生物软件Bioedit进行比对分析筛选出保守序列,在保守区域设计特异引物和探针,建立检测DENV-2的TaqMan荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法。结果该方法检测灵敏度达到102copies/μL;特异性验证中除登革2型病毒有明显扩增外,与墨累谷脑炎病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒、登革病毒1、3、4型、黄热病毒和科萨努尔森林病毒、乙型脑炎病毒均无交叉反应。重复性实验结果表明该方法的组间和组内的变异系数(CV)均<2%。对人工感染DENV-2的87只蚊虫标本进行比对实验,结果荧光定量RT-PCR检测出56份阳性,传统RT-PCR只检测出16份阳性,差异有统计学意义(χ~2=37.908,P=0.000)。结论 TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测DENV-2,特异性强、敏感性高。

摘要：目的构建基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统。方法构建sacB毒蛋白诱导表达受体质粒pACYC-sacB(携带p15A复制子),分析sacB毒蛋白对大肠埃希菌的毒性。设计sacB基因打靶位点,构建脱水四环素诱导的Targetron供体质粒pSY11-sacB(携带colE1复制子和sacB405a打靶位点)。双质粒共转化大肠埃希菌BL21(DE3),脱水四环素诱导Targetron表达并对sacB基因进行打靶。涂布含有5%蔗糖和0.1 mmol/L IPTG的选择培养基,筛选sacB基因失活的阳性菌落,利用菌落PCR进一步验证Ⅱ型内含子在靶位点的插入情况。结果sacB基因表达的大肠埃希菌不能在含有5%蔗糖的平板中生长;双质粒共转化后,脱水四环素诱导Targetron表达能够插入到sacB405a靶位点;sacB基因失活后,大肠埃希菌能够在含有5%蔗糖的平板上生长,菌落PCR验证内含子插入到DNA靶位点。结论建立了基于sacB负筛选标记的Targetron质粒分析系统,为Ⅱ型内含子功能鉴定、迁移规律分析等奠定了基础。