摘要：目的 研究沉默线粒体分裂蛋白1（Fis1）对人脑神经母细胞瘤细胞株（SH-SY5Y细胞）Fis1、线粒体融合蛋白1（Mfn1）及线粒体膜电位水平的影响，并进一步探讨线粒体融合分裂在慢性氟中毒发病机制中的作用。方法 体外培养SH-SY5Y细胞，待细胞贴壁生长进入对数增长期时进行实验，采用成组设计将细胞分为未染氟空白对照组、染氟组［2 mmol／L氟化钠（NaF）］、染氟阴性对照组［2 mmol／L NaF ＋ 非特异性小干扰RNA（siRNA）］、沉默组（2 mmol／L NaF ＋ siRNA-Fis1）。蛋白质印迹法（Western blot）检测细胞中Fis1和Mfn1蛋白表达水平；实时荧光定量PCR（Real-time PCR）检测Fis1和Mfn1 mRNA表达水平；线粒体膜电位检测试剂盒检测细胞线粒体膜电位水平。结果 与空白对照组（1.37 ± 0.18、1.00 ± 0.04，1.57 ± 0.19、1.00 ± 0.04，1.00 ± 0.10）比较，染氟组Fis1蛋白（1.72 ± 0.04）及mRNA表达水平（1.48 ± 0.13）均升高，Mfn1蛋白（0.87 ± 0.02）及mRNA表达水平（0.69 ± 0.07）均降低，线粒体膜电位水平（0.76 ± 0.13）降低（P均 〈 0.05）。与空白对照组比较，沉默组Fis1蛋白（0.79 ± 0.07）及mRNA表达水平（0.06 ± 0.03）均降低，Mfn1蛋白（1.71 ± 0.04）及mRNA表达水平（1.52 ± 0.05）均升高（P均 〈 0.05），线粒体膜电位水平（0.94 ± 0.01）有降低趋势。与染氟组比较，沉默组Fis1蛋白及mRNA表达水平均降低，Mfn1蛋白及mRNA表达水平均升高，线粒体膜电位水平升高（P均 〈 0.05）。结论 人工抑制Fis1基因表达水平可降低氟致SH-SY5Y细胞的线粒体分裂和线粒体膜电位损伤。

摘要：目的评估线粒体分裂蛋白1(Fis1)在甲基苯丙胺(METH)诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)损伤中的作用。方法采用成组设计方法,将体外培养SH-SY5Y细胞分为不同组别:未沉默组、沉默阴性组和沉默组,不同浓度的METH诱导各组SH-SY5Y细胞24 h。利用Western blot检测Fis1蛋白表达水平,使用CCK-8细胞毒性增殖实验分析METH对SH-SY5Y细胞增殖能力的影响,利用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测METH对SH-SY5Y细胞MMP水平的影响,使用透射电镜观察METH对SH-SY5Y细胞线粒体超微结构的影响。结果未沉默组、沉默阴性组和沉默组中,与对照组比较,各组组内随METH诱导SH-SY5Y细胞的浓度升高,Fis1蛋白表达水平升高(P<0.05)、增殖能力减弱(P<0.05)、MMP水平降低(P<0.05);与未沉默组和沉默阴性组相同浓度比较,沉默组SH-SY5Y细胞Fis1蛋白表达水平降低(P<0.05),增殖能力增强(P<0.05),MMP水平升高(P<0.05)。组内与对照组比较,2.0mmol·L^-1 METH诱导未沉默组、沉默阴性组和沉默组,透射电镜观察见线粒体小球状结构增多(P<0.01)。结论Fis1可能在METH诱导体外培养SH-SY5Y细胞损伤中起关键作用。

摘要：目的:设计人乳头状瘤病毒(HPV)基因芯片的质量控制点,优化质量控制探针和人β珠蛋白基因引物浓度以及HPV引物浓度比例,以提高基因芯片的检测质量。方法:收集临床HPV患者宫颈刮片样本,提取样本HPV58的DNA,用HPV通用引物扩增病毒DNA;利用人β珠蛋白引物扩增样本中的β珠蛋白DNA,将扩增的PCR产物与线性化的p MD18-T载体连接,构建人β珠蛋白和HPV58 L1区DNA质粒,转化大肠杆菌后,进行单克隆培养,获得HPV58样本和人β珠蛋白的DNA模板;以HPV58和人β珠蛋白DNA基因信息设计并制备扩增HPV和人β珠蛋白探针及PCR引物,将人β珠蛋白基因探针固定于基因芯片作为质量控制点(QC),按1∶20、1∶10、1∶5和1∶4比例混合单克隆HPV扩增引物与人β珠蛋白扩增引物,采用PCR反向点杂交技术,对模板进行扩增后,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的产量,进行基因芯片孵育杂交和显色;用扫描仪扫描芯片,采用Image J软件对各阳性杂交信号点进行信号强度采集,计算最佳的人β珠蛋白扩增引物和HPV扩增引物浓度比值;将QC的探针点样浓度设为0. 1 pmol/L、1 pmol/L、10 pmol/L、50 pmol/L和100 pmol/L,检测信号强度,优化质量控制探针点样浓度。结果:扩增了HPV58病毒DNA和人β珠蛋白的DNA模板,设计了HPV58和人β珠蛋白探针及PCR引物;琼脂糖凝胶电泳检测分析发现,当人β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的浓度比例为1∶10时,二者同时PCR扩增时,扩增的强度较为一致,得到的产物量相当,用此引物浓度比例进行PCR获得的产物与测试芯片进行杂交,显色的平衡性较好;对QC的点样浓度进行测试发现,当QC点样探针浓度为50 pmol/L时,可以获得最佳的检测效果。结论:通过对β珠蛋白扩增引物与HPV扩增引物的最佳浓度比例和质量控制探针最佳点样浓度的优化,提高了HPV检测点的检测质量。

摘要：目的:利用RNA干扰技术,以蛋白激酶B 2(AKT2)的mRNA为靶点,设计、构建AKT-2的RNA干扰慢病毒载体,并对其沉默效果进行验证。方法:根据目的基因设计3个小干扰RNA(siRNA)靶点,进行引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列,连接入双酶切线性化的RNA干扰载体。测序验证正确的转化子,进行高纯度质粒抽提。提取3种阳性克隆质粒测序,转染HEK293-T细胞后产生慢病毒质粒。实验大鼠被随机分为5组,每组10只,空白对照组不注射慢病毒,NC-shRNA阴性感染组、PL-AKT2-shRNA-1感染组、PL-AKT2-shRNA-2感染组、PL-AKT2-shRNA-3感染组。大鼠附睾分别被注射200μL含有NC-shRNA、PL-AKT2-shRNA-1、PLAKT2-shRNA-2、PL-AKT2-shRNA-3的病毒液;免疫印迹检测大鼠附睾AKT2的蛋白沉默效果。结果:测序结果证明3种慢病毒载体被包装成功。感染大鼠附睾后,AKT2的蛋白表达量均较阴性感染组和正常对照组明显降低,其中以PL-AKT2-shRNA-3质粒组干扰效果更为有效。结论:成功设计了AKT-2基因的RNA干扰靶点和制备了AKT-2基因的慢病毒载体,基因沉默效果明显。