摘要：背景:研究报道敲低MKRN1可以抑制肿瘤细胞的生长,但MKRN1是否作为肿瘤相关蛋白在机体发挥作用还需进一步研究。由于siRNA介导的基因沉默是瞬时表达,持续时间短且常规慢病毒技术存在脱靶效应,利用四环素调控(Tet-on)慢病毒系统构建稳定沉默MKRN1基因的细胞系有着可逆的优势,且可规避上述缺点,对于深入研究MKRN1的生物学功能有重要的意义。目的:构建Tet-on慢病毒系统介导的MKRN1基因沉默载体,研究沉默MKRN1基因表达对人胚胎肾细胞HEK-293T增殖、凋亡的影响。方法:采用RNAi技术,针对MKRN1基因设计3条shRNA(命名为sh1,sh2,sh3),将3条shRNA序列连入四环素诱导表达载体pTripz中验证连入序列;通过三质粒系统转染HEK-293T细胞,并用含有1 mg/L强力霉素的完全培养基培养,进行慢病毒包装,收取48 h及72 h病毒液,将其浓缩后感染HEK-293T细胞,感染48 h后用荧光显微镜观察病毒感染效率。通过实时荧光定量PCR、Western blot检测MKRN1的敲减效率;Western blot检测四环素诱导表达系统是否构建成功;通过集落形成实验及Western blot检测沉默MKRN1表达后对HEK-293T细胞增殖、凋亡能力的影响。结果与结论:(1)设计的3条MKRN1-短发夹RNA(sh1、sh2、sh3),均成功连入Tet-on载体,且各组载体序列正确;通过慢病毒成功感染HEK-293T细胞;(2)实时荧光定量PCR及Western blot检测发现3条shRNA序列中1号序列敲低MKRN1水平明显降低(P<0.05),且沉默组不加入强力霉素诱导后目的基因的表达得到回复;(3)集落形成实验发现沉默MKRN1后HEK-293T细胞增殖能力下降(P<0.05);Western blot检测敲低MKRN1后,增殖细胞核抗原表达下调,细胞凋亡相关指标BAX表达增加,Bcl2表达下调,Bcl2/BAX的比值下调(P<0.001);(4)结论:采用Tet-on慢病毒载体系统构建了稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞株,且沉默MKRN1后能够抑制HEK-293T细胞的增殖,并促进其凋亡。通过构建稳定沉默MKRN1的HEK-293T细胞可为进一步研究MKRN1的生物学功能奠定基础,也为研究其他基因的生物学功能提供一个方法学上的参考。

摘要：目的：利用吗啉代寡核苷酸技术建立下调斑马鱼 lmna 基因的技术方法。方法在斑马鱼 lmna 基因序列中选择靶点，设计针对斑马鱼 lmna 基因的吗啉代寡核苷酸序列（lmna－MO），构建能特异指示 lmna 基因表达的 lmna－EGFP－pCS2＋重组质粒，并通过显微注射方式将二者共注射入斑马鱼胚胎中，通过观察胚胎中绿色荧光表达量反应 lmna 基因表达量，并通过蛋白质印迹法检测胚胎中 lamin 蛋白表达量。结果蛋白质印迹法检测斑马鱼体内 lamin 蛋白的表达，分别有大小为69 KD 和62 KD 两种蛋白表达。设计并构建了 lmna－MO 和重组质粒 lmna－EGFP－pCS2＋，单独注射 lmna－EGFP－pCS2＋质粒后观察到从6 hpf 到96 hpf 胚胎均有绿色荧光蛋白表达；二者共注射后观察到，与对照组相比，实验组从6 hpf 至30 hpf 胚胎中绿色荧光蛋白表达量均不同程度下降或消失；蛋白质印迹实验结果显示实验组胚胎内 lamin 蛋白表达量明显下降。表明已成功下调了斑马鱼胚胎 lmna 基因表达。结论可通过 lmna－MO 和重组质粒 lmna－EGFP－pCS2＋共注射方法下调斑马鱼 lmna 基因表达，并通过绿色荧光蛋白表达量反映下调效果。该方法可为深入研究人核纤层病提供良好的动物模型。

摘要：背景:构建三维的预血管化系统,对于大尺寸、复杂三维结构组织内细胞的存活和功能表达均具有决定性作用。因此,寻找一种合适的预血管化策略已成为3D生物打印大尺寸、复杂三维组织亟待解决的问题。目的:对3D生物打印大尺寸、预血管化三维结构进行初步的探索。方法:用逆向工程软件Catia设计三维生物打印蓝图;以改装后的桌面级双喷头3D打印机为生物打印机,以聚乙烯醇为牺牲材料打印牺牲骨架;以大鼠骨髓间充质干细胞、海藻酸钠、琼脂糖和纳米纤维素溶液的混合物为细胞生物墨水。根据预先设计的参数进行生物打印,构建具有三维流体通道的组织工程三维结构体。观察打印获得的三维结构体,评价打印后及材料溶解后的细胞活性;体外培养打印获得的结构体,并用Alamar Blue试剂盒检测细胞在三维结构体中的增殖。结果与结论:利用Catia软件设计出了具有微孔的外壁及内部纵横交错的微管结构的双喷头打印模型,用该三维生物打印技术构建出具有自定义尺寸(尤其是高度)和预血管化的三维结构,结构体中细胞12h的存活率为(95.47±0.54)%,随着体外培养时间的延长,细胞存活率下降并稳定在80%以上。随着培养时间的增加,构建体中的细胞增殖呈上升趋势。结果表明:该生物打印方法可用于通过使用各种生物水凝胶材料制造不同特性的三维结构体,在生物制造具有临床相关尺寸的预血管化的复杂组织器官方面具有潜力。

摘要：目的:探讨等温链置换扩增结合纳米金测流层析试纸条用于登革热病毒(DENV)快速检测的可行性。方法:采用磁珠富集法提取病毒总RNA,并逆转录为cDNA用于等温链置换扩增检测体系;等温链置换扩增用于检测DENV,琼脂糖凝胶电泳用于分析等温链置换扩增产物及其检测的敏感度;采用柠檬酸三钠还原法制备用于试纸条的纳米金颗粒;利用核酸碱基互补配对原理设计纳米金测流层析试纸条的检测线与控制线,建立DENV的检测体系。结果:等温链置换扩增的敏感度为10 fmol/L。基于等温链置换扩增的纳米金测流层析试纸条检测DENV的敏感度也为10 fmol/L,取其检测样品浓度的对数值进行线性分析,检测浓度范围为10～10^(12)fmol/L,符合线性回归方程,线性相关系数(R^2)为0. 98。基于等温链置换扩增的纳米金测流层析试纸条检测DENV的特异性较高,与其他对照组无交叉。结论:建立了基于等温链置换扩增反应的纳米金试纸条用于DENV的检测方法,检测结果肉眼可见,敏感度高,可用于DENV的快速检测。

摘要：目的设计合成HIV-1病毒感染因子(Vif)抑制剂RN-18的衍生物并测试其抗HIV-1活性。方法以RN-18为先导化合物,针对其两个支链及中间苯环设计合成衍生物,以p24含量来检测化合物抑制HIV-1的增殖活性,最后通过MTT法评价抗病毒效果较好化合物的细胞毒性。结果共合成得到28个RN-18衍生物,结构经MS、NMR表征。活性测试表明,7个化合物抗HIV-1活性较RN-18更为显著,其中化合物26的活性提升了11倍以上,EC50值达到了21.8μmol·L^(-1)。结论将RN-18的苯环替换为杂环可普遍提高抗HIV-1活性,为该类化合物的进一步优化指明了方向。

摘要：本文选取42个2,4-二氨基嘧啶类黏着斑激酶(FAK)小分子抑制剂,分别以比较分子场分析法(CoMFA)与相似性指数分析法(CoMSIA)构建3D-QSAR模型,评价模板分子、公共骨架点、最小能量优化参数、分子构象等因素对模型优化的影响。分析最优模型中立体场、静电场以及氢键等因素对抑制剂活性的影响,并应用分子对接分析该类抑制剂与FAK蛋白的相互作用。结果表明,选择化合物16作为模板分子,骨架A作为公共骨架点,最小能量优化参数中电荷、最大迭代系数、最低能量限定值分别为MMFF94、1000、0.01kcal/mol时所构建的模型最优。以CoMFA和CoMSIA构建的3D-QSAR模型的交叉验证系数(q^(2))分别为0.666和0.736,非交叉验证系数(R^(2))分别为0.990和0.989,表明此模型具有良好的预测能力。分子对接分析显示,其与FAK的氨基酸残基CYS502、ASP564形成了重要的氢键作用,并与周围残基形成了较强的疏水作用。通过3D-QSAR的构建与分子对接分析,可指导2,4-二氨基嘧啶类FAK小分子抑制剂的进一步结构优化设计。

摘要：目的:应用规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR/Cas9)技术构建敲除BLM基因的人乳腺癌MDA-MB-231细胞株。方法:根据CRISPR/Cas9技术靶点设计原则,在BLM基因的3号外显子设计2条靶向小向导RNA(sgRNA),利用PX459 V2质粒载体,构建PX459 V2-sgRNA重组质粒;将建构成功的重组质粒转染至MDA-MB-231细胞中,通过嘌呤霉素筛选获得阳性克隆,使用Cruiser^(TM)核酸内切酶检测打靶效率,将打靶效率较高的阳性克隆进行单克隆培养,再利用免疫印迹法检测筛选出敲除BLM基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞株。结果:测序结果表明重组质粒构建成功,免疫印迹法显示敲除BLM基因后的MDA-MB-231细胞中BLM蛋白明显降低,与空白对照组相比,BLM-KO组BLM表达水平明显低于对照组。结论:应用CRISPR/Cas9技术成功构建了BLM基因敲除的MDA-MB-231细胞株。

摘要：目的：用band3基因的反义 mRNA探针进行斑马鱼全胚胎原位杂交，检测 band3基因在野生型Tüebingen斑马鱼胚胎发育过程中的表达。方法：Trizol法提取斑马鱼胚胎总RNA并设计特异性引物，采用RT-PCR法扩增band3基因cDNA编码区片段；通过基因重组技术构建PBSK-band3重组质粒，用BamHⅠ酶切得到线性化PBSK-band3；以T7 RNA聚合酶转录合成反义地高辛标记的band3 RNA探针，用全胚胎原位杂交法检测band3基因在斑马鱼胚胎早期的表达情况。结果：成功克隆band3基因片段，构建PBSK-band3重组质粒；经体外转录获得地高辛标记的反义band3 mRNA探针，原位杂交后检测证实band3基因在斑马鱼胚胎早期发育过程中间细胞群（ICM）和主动脉性腺中肾区（AGM）呈现高表达。结论：地高辛标记的反义band3 mRNA探针可检测到斑马鱼胚胎中band3基因的定位表达。

摘要：目的探讨利用吗啉代寡核苷酸技术(MO)下调lmna后斑马鱼胚胎细胞的凋亡机制。方法在目的基因lmna序列中选择靶点,设计针对目的基因的吗啉代寡核苷酸序列(lmna-MO),利用显微注射技术,将lmna-MO注射到野生型斑马鱼(Tüebingen品系)胚胎中,下调斑马鱼lmna基因。采用流式细胞技术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡蛋白p-AKT、AKT及BCL-2的表达量。结果注射lmna-MO后24和72 h,斑马鱼胚胎均存在细胞早期凋亡,且与药物暴露时相存在相关性(P<0.01);lmna-MO注射后24和72 h,p-AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P<0.01);AKT蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有增加(P<0.05);而BCL-2蛋白的表达较野生型胚胎的表达均有下降(P<0.05)。结论 lmna基因参与调控斑马鱼胚胎细胞凋亡过程,其机制可能与AKT蛋白及BCL-2蛋白的表达有关;p-AKT(S473)参与AKT通路活化,而lmna基因下调可促进AKT磷酸化,通过活化P13K/AKT信号通路来抑制凋亡促进细胞存活,但其并非唯一凋亡调控机制。

摘要：目的:研究甲基结合蛋白1(Mbd1)对小鼠胚胎干细胞克隆形态及增殖的影响。方法:设计针对Mbd1转录起始位点的gRNA,将表达有gRNA和Cas9蛋白的质粒使用脂质体转染方法转入小鼠胚胎干细胞(J1);使用抗生素将未转染成功的细胞杀死后,细胞继续培养7d,挑取单克隆细胞,采用PCR法筛选敲除Mbd1的纯合子细胞,观察Mbd1缺失对小鼠胚胎干细胞克隆形态的影响;使用细胞计数法检验Mbd1对胚胎干细胞增殖的影响。结果:通过Cripsr/Cas9成功获得敲除Mbd1的胚胎干细胞,Mbd1缺失后的小鼠胚胎干细胞丧失了常规小鼠胚胎干细胞的3D克隆形态,细胞呈现单层扁平克隆;Mbd1缺失后小鼠胚胎干细胞增殖速率变慢。结论:Mbd1通过影响小鼠胚胎干细胞克隆形态和增殖而影响胚胎干细胞的多能性。