摘要：目的克隆家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)的cDNA序列并对其编码的蛋白序列进行生物信息学分析。方法根据MAF-1的N端30个氨基酸序列设计简并引物,采用RACE法和巢式PCR技术克隆MAF-1的3′端和5′端cDNA序列,获得MAF-1的cDNA序列和氨基酸序列。根据所得MAF-1成熟肽部分的cDNA序列设计引物进行RT-PCR,对序列进行验证并运用生物信息学软件进行分析。结果 MAF-1的3′端cDNA序列长度为568bp,开放阅读框长度为441 bp,编码蛋白序列共147个氨基酸,3′端非编码区127bp。经NCBI中Blast比对未找到同源序列,提示该基因为一全新序列,登录到GenBank,获得登录号HM178948。该基因编码的147个氨基酸加上MAF-1的N端未用来设计引物的9个氨基酸,全长共156个氨基酸。由5′RACE获得139 bp cDNA序列,分析所得MAF-1成熟肽的氨基酸序列与前述一致。RT-PCR结果证实了RACE所得MAF-1序列的正确性。根据生物信息学分析方法对所推导的MAF-1蛋白全长序列进行分析,其理论相对分子质量和等电点均与其实际检测值相近。利用ExPASy的各种分析工具对MAF-1分析得知,该蛋白具有信号肽,富含α螺旋,有3个α螺旋区,亚细胞定位分析其主要分布于细胞核内。利用PredictProtein分析发现,MAF-1序列中有2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个N端酰基化位点,并预测MAF-1为非球形蛋白。最后,利用ExPASy中的3D-pssm(Phyre Version0.2)模建了MAF-1的三维空间结构图。结论成功克隆了家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)的cDNA序列,获知其编码的氨基酸序列和生物信息学信息。

摘要：目的了解腺苷脱氨酶(adenosine deaminase,ADA)基因、C型凝集素(C-lectin)基因和丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor,serpin)基因在白纹伊蚊唾液腺中的表达情况。方法分别制备未吸血雌蚊唾液腺(SG组)和吸血雌蚊唾液腺(BSG组)、雌蚊躯体(无头无唾液腺,C组)和雄蚊组织(无头含唾液腺,M组)的总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术,以β肌动蛋白(β-actin)基因作为内参,根据GenBank公布的ADA、C-lectin和Serpin基因序列设计特异性引物进行RT-PCR,分析以上基因在不同组织中的表达情况。结果与雌蚊躯体和雄蚊组织中相对表达量相比,ADA基因在雌蚊唾液腺中的表达分别提高了545倍和123倍(P0.05)。结论 ADA在蚊虫组织中均有表达,在雌蚊唾液腺中高表达;C-lectin和serpin基因在雌蚊唾液腺中特异高表达。

摘要：目的建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法。方法根据GenBank上白纹伊蚊β-actin基因的序列（GenBank accession number：DQ657949）,利用Primer Express3.0软件设计并合成一对引物,采用SYBRGreen I作为染料建立实时荧光定量RT-PCR法。以Ct值为纵坐标,以稀释倍数的对数为横坐标,建立标准曲线,并进行溶解曲线分析。结果标准曲线Ct值检测范围为15~30,扩增效率为97.9%,相关系数为0.996,溶解曲线分析结果显示产物为特异的单峰,其Tm值为86.4℃。结论成功建立白纹伊蚊β-actin基因实时荧光定量RT-PCR法,为β-actin基因作为内参基因进行白纹伊蚊功能基因表达差异研究奠定基础。

摘要：目的克隆并原核表达白纹伊蚊唾液腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因1(Aalbserpin-1)。方法根据NCBI网站上白纹伊蚊Aalbserpin-1(AY826096.1)的序列设计引物,用RT-PCR从白纹伊蚊广州株中获取Aalbserpin-1全长基因序列,并进行生物信息学分析。将目的片段克隆到原核表达载体pET28a(+),转化到大肠杆菌中诱导表达。利用实时荧光定量RTPCR分析Aalbserpin-1_2基因在白纹伊蚊不同组织中的表达差异。结果 PCR扩增获得Aalbserpin-1基因两个转录本(Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2),Aalbserpin1_1的基因序列为1 260bp,编码419个氨基酸;Aalbserpin1_2的基因序列为1 332bp,编码443个氨基酸,均具有seprin结构域,Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2与Aalbserpin-1(AY826096.1)相比,相似性分别为95%和90%。两个转录本比较,Aalbserpin1_2中含有24个氨基酸的可变剪接子正好位于其功能活性中心环(RCL)上。以Aalbserpin1_2序列为模板,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒。SDS-PAGE结果显示目的基因在Origami(DE3)中表达,重组蛋白相对分子量(Mr)约为50 000Da,经亲和层析获得目的蛋白。组织表达谱显示Aalbserpin-1_2在唾液腺(SG)、中肠(MG,P>0.05)丰富表达,脂肪体低表达(FB,P<0.05)。结论白纹伊蚊广州株Aalbserpin-1基因具有两个可变剪接子,其中Aalbserpin-1_2在唾液腺、中肠丰富表达,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒并获得重组蛋白。

摘要：目的探讨临床不同分离株阴道毛滴虫核糖体DNA基因转录间隔区(rDNA ITS)序列多态性与甲硝唑抗性表型之间的相关性。方法采用微孔板法检测39株达到纯培养的阴道毛滴虫虫株对甲硝唑敏感性,同时设计rDNA-ITS区特异引物进行PCR扩增并测序。结果39个虫株中,甲硝唑敏感虫株20株,耐药虫株19株;PCR扩增获得ITS区和5.8 S特异片段长度为285 bp。经DNAStarM egA lign比对显示,仅在ITS1区存在唯一点突变,即C66T突变。39个虫株中有8株具C66T突变,其中6株来自甲硝唑敏感虫株,2株来自甲硝唑耐药虫株。经F isher确切概率检验,χ2=0.108,P>0.05。结论阴道毛滴虫临床分离株ITS区C66T突变与甲硝唑抗性表型无明显相关性。

摘要：目的克隆白纹伊蚊唾液腺黏蛋白相关蛋白基因1(Aamucin1)的全长cDNA序列,并分析白纹伊蚊吸血前后基因表达的差异。方法根据白纹伊蚊罗马株Aamucin1基因序列(GenBank序列号为AY826068)设计特异引物,提取白纹伊蚊广州株唾液腺总RNA,PCR扩增Aamucin1全长基因序列,并进行生物信息学分析。实时荧光定量RT-PCR分析白纹伊蚊吸血前后Aamucin1基因表达差异。结果成功克隆白纹伊蚊广州株基因,并获得全长为849 bp的基因序列,编码283个氨基酸。白纹伊蚊广州株与罗马株Aamucin1基因序列比对在C端少了13个氨基酸。与罗马伊蚊同源序列的一致性为58%;该基因具有1个可变剪接子;Protscan分析示有苏氨酸丰富区,可变剪接子恰位于此区;饱血零时(吸血2 h,腹部饱胀者,为BSG_0组),Aamucin1基因表达显著下调,是吸血前(SG组)的0.39倍(P0.05)。结论获得白纹伊蚊广州株Aamucin1基因全长序列,并证实其在mRNA水平受到吸血调控。

摘要：目的克隆并表达白纹伊蚊唾液腺Aalb_34ku-2蛋白。方法根据白纹伊蚊(罗马株)34ku-2开放读码框序列(Aalb_34ku-2)(GenBank:AY826118.1)设计特异引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊广州株雌蚊体内扩增获得Aalb_34ku-2基因。利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白序列的分析工具,结合其他生物信息学分析软件包,分析预测该蛋白质的结构功能;将该基因克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,重组质粒在大肠埃希菌BL21/DE3中经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定。结果 RT-PCR扩增获得Aalb_34ku-2 2个转录本。Aalb_34ku-2_1序列长度为954bp,编码318个氨基酸,等电点为5.84;Aalb_34ku-2_2的ORF为882bp,编码294个氨基酸,等电点为6.09。两者相差24个氨基酸;构建Pet28a(+)-Aalb_34ku-2_1重组表达载体并转入大肠埃希菌*** BL21(DE3),IPTG诱导后得到的重组蛋白与目的蛋白分子质量(34ku)相符,经鉴定为包涵体蛋白。结论成功构建pET28a(+)-Aalb_34ku-2_1重组原核表达质粒并表达出融合蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

摘要：应用正交设计试验方法探讨了影响阿米巴免疫粘附玫瑰花形成的诸多因素,发现抗体浓度,补体浓度、孵育温度及指示人红细胞浓度均对成花率有显著影响,其中孵育温度为主要因素。还用本法确定了免疫粘附玫瑰花试验的佳化方案。另外,用绵羊红细胞作载体结合阿米巴可溶性抗原,成功地进行了微量免疫粘附血凝试验。该方法灵敏、可靠、特界性强,所用抗原试剂量少,有实用和推广价值。

摘要：目的对亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)成虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4(Actin relatedprotein2/3complex subunit4)基因进行克隆、表达和免疫学研究。方法以亚洲牛带绦虫cDNA文库中肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4的已知序列设计合成一对特殊引物,进行PCR技术扩增目的基因,克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在CaCl2制备的感受态大肠埃希菌BL21/DE3中经过异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导目的基因表达,表达产物经过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定。由于蛋白在包涵体表达,故通过N-十二烷基肌氨酸钠(SKL)法纯化获得纯化重组蛋白并用蛋白印迹(Western-blotting)进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及DNA测序结果均表明,pET-28a(+)-Arp2/3重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明,基因在大肠埃希菌BL21/DE3包涵体中表达,经过包涵体沉淀的溶解、重折叠和离子交换层析方法获得高纯度蛋白。重组蛋白能识别亚洲牛带绦虫患者及牛带绦虫患者血清,表明该蛋白具有免疫反应性。结论成功克隆亚洲牛带绦虫肌动相关蛋白2/3复合体亚单位4基因,表达和纯化得到了该基因的重组蛋白并且证明该基因具有免疫反应性,为进一步研究该基因的功能提供条件。

摘要：多媒体组合课堂教学设计（一）包怀恩，詹业著，李建华，万明明，王宝磷，徐小兴，陈艳，徐小安（贵阳医学院寄生虫学教研室贵阳５５０００４贵阳医学院电化教育教研室）随着现代科技的发展，视听教育技术已越来越广泛地应用于医学教育，对改革传统教学方法和教学思想发挥...