摘要：目的克隆并原核表达白纹伊蚊唾液腺丝氨酸蛋白酶抑制剂基因1(Aalbserpin-1)。方法根据NCBI网站上白纹伊蚊Aalbserpin-1(AY826096.1)的序列设计引物,用RT-PCR从白纹伊蚊广州株中获取Aalbserpin-1全长基因序列,并进行生物信息学分析。将目的片段克隆到原核表达载体pET28a(+),转化到大肠杆菌中诱导表达。利用实时荧光定量RTPCR分析Aalbserpin-1_2基因在白纹伊蚊不同组织中的表达差异。结果 PCR扩增获得Aalbserpin-1基因两个转录本(Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2),Aalbserpin1_1的基因序列为1 260bp,编码419个氨基酸;Aalbserpin1_2的基因序列为1 332bp,编码443个氨基酸,均具有seprin结构域,Aalbserpin1_1和Aalbserpin1_2与Aalbserpin-1(AY826096.1)相比,相似性分别为95%和90%。两个转录本比较,Aalbserpin1_2中含有24个氨基酸的可变剪接子正好位于其功能活性中心环(RCL)上。以Aalbserpin1_2序列为模板,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒。SDS-PAGE结果显示目的基因在Origami(DE3)中表达,重组蛋白相对分子量(Mr)约为50 000Da,经亲和层析获得目的蛋白。组织表达谱显示Aalbserpin-1_2在唾液腺(SG)、中肠(MG,P>0.05)丰富表达,脂肪体低表达(FB,P<0.05)。结论白纹伊蚊广州株Aalbserpin-1基因具有两个可变剪接子,其中Aalbserpin-1_2在唾液腺、中肠丰富表达,成功构建pET28a-Aalbserpin-1_2重组质粒并获得重组蛋白。

摘要：目的克隆并表达白纹伊蚊唾液腺Aalb_34ku-2蛋白。方法根据白纹伊蚊(罗马株)34ku-2开放读码框序列(Aalb_34ku-2)(GenBank:AY826118.1)设计特异引物,采用RT-PCR技术从白纹伊蚊广州株雌蚊体内扩增获得Aalb_34ku-2基因。利用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统中有关基因和蛋白序列的分析工具,结合其他生物信息学分析软件包,分析预测该蛋白质的结构功能;将该基因克隆到原核表达质粒pET28a(+)中,重组质粒在大肠埃希菌BL21/DE3中经异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达,表达产物用SDS-PAGE电泳鉴定。结果 RT-PCR扩增获得Aalb_34ku-2 2个转录本。Aalb_34ku-2_1序列长度为954bp,编码318个氨基酸,等电点为5.84;Aalb_34ku-2_2的ORF为882bp,编码294个氨基酸,等电点为6.09。两者相差24个氨基酸;构建Pet28a(+)-Aalb_34ku-2_1重组表达载体并转入大肠埃希菌*** BL21(DE3),IPTG诱导后得到的重组蛋白与目的蛋白分子质量(34ku)相符,经鉴定为包涵体蛋白。结论成功构建pET28a(+)-Aalb_34ku-2_1重组原核表达质粒并表达出融合蛋白,为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。

摘要：目的为寻找猪囊尾蚴病新的免疫学候选诊断分子奠定基础。方法设计合成引物,用PCR法从cDNA文库中扩增出猪囊尾蚴抗原6H基因编码序列,将其克隆入PMD-18T载体,然后在原核表达载体PET-28a中亚克隆,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot观察表达结果。结果用PCR法扩增出一条大小约774bp的特异性片段,克隆质粒PMD-18T-6H和原核表达质粒PET-28a-6H作BamHⅠ和XhoⅠ双酶切和以重组质粒为模板进行PCR扩增,均可获得一条与PCR产物一致的DNA片段。诱导表达后,经SDS-PAGE可见一条约33kDa大小的融合蛋白条带,Western blot结果显示其可与猪囊尾蚴病人血清起反应。结论本实验成功地克隆了猪囊尾蚴抗原6H编码基因,并在原核细胞中进行了表达及鉴定,为进一步免疫诊断研究奠定了基础。

摘要：目的克隆贵阳腐霉、Pr2蛋白酶的cDNA片段,改造贵阳腐霉基因。方法用几丁质诱导培养基培养贵阳腐霉24 h,然后抽提菌丝的总RNA,反转录合成cDNA第1链,根据Pr2蛋白酶的氨基酸保守序列设计合成简并引物,以cDNA第1链为模板,采用降落PCR技术扩增,将扩增的产物纯化、连入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,送阳性克隆子测序。结果所获片段中,1个215 bp的cDNA片段与trypsin样蛋白酶家族基因有较高的相似性,其中与亚洲玉米螟的类胰蛋白酶基因相似性最大(52.8%)。结论这一DNA片段可能是贵阳腐霉Pr2蛋白酶的1条cDNA片段,更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段,并加以证实。