摘要：目的建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测鼠伤寒沙门菌和(Salmonella typhimurium,ST)和肠炎沙门菌(Salmonella enteritidis,SE)的方法。方法根据ST的STM4599序列(GenBank:AERV01000023.1)和SE特异序列(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,ST探针的5'端标记FAM、SE探针的5'端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。结果 ST和SE的引物和探针分别特异性地扩增出16株ST和15株SE,而28种不同血清型沙门菌和17株变形杆菌等扩增结果均为阴性。ST和SE的双重荧光PCR扩增效率均为94.2%,R2分别为0.998和0.995,最低检测浓度分别达到300 CFU/ml、260 CFU/ml。结论建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31h完成,是快速检测ST和SE的有效方法,可用于食品中ST和SE的特异性检测。

摘要：以单核细胞增生李斯特氏菌iap基因为靶基因，利用一新型PCR引物设计方法——双启动引物（Dual-primingoligonucleotide，DPO），建立了特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的DPO—PCR方法，测试了DPO—PCR方法退火温度不敏感性、特异性及灵敏度，并在实践检测中进行了初步应用。结果显示：该方法检测单核细胞增生李斯特氏菌的灵敏度为1．51×10^2CFU／mL；退火温度不敏感性测试中，与常规PCR引物相比，DPO引物在48～68℃退火温度范围内均能够高效率地扩增靶基因；特异性测试中，DPO—PCR方法能特异地检测出目标菌，与其他菌株无非特异性扩增反应，比常规PCR方法显示出更强的特异性。实践应用证明，利用DPO—PCR方法对130份样本进行检测，共计检出9份单核细胞增生李斯特氏菌阳性样本，经国标法（GB／T4789．30—2008）复检，两者检测结果一致，显示出良好的实用性，为单核细胞增生李斯特氏菌的快速准确检测提供了新方法。

摘要：建立基于TaqMan探针双重重实时荧光PCR检测肠道沙门氏菌(Salmonella enterica,SP)和肠炎沙门氏菌(Salmonella Enteritidis,SE)的方法。根据SP的aceA基因(Gen Bank:U43344.1)、肠炎沙门氏菌特异序列SEP(GenBank:AF370707.1),分别设计引物和探针,在ace A探针的5′端标记FAM和SEP探针的5′端标记VIC,建立基于TaqMan探针双重荧光PCR检测方法。试验结果,58株29种不同血清型肠道沙门氏菌均扩增出ace A基因扩增曲线,SEP特异性地扩增出15株SE,而28种不同血清型沙门氏菌和17株变形杆菌等阴性对照株扩增结果均为阴性。ace A和SEP的双重荧光PCR扩增效率分别为100%和104%,R2分别为0.999和0.998,最低检测浓度分别达到280 cfu/m L和260 cfu/m L。建立的方法特异性好、灵敏度高,整个试验可在31 h完成,是快速检测SP和SE的有效方法,可用于食品中SP和SE的特异性检测。

摘要：建立了牙鲆弹状病毒的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,首先根据牙鲆弹状病毒的糖蛋白的基因保守序列,利用Primer Explorer V3软件设计了6条引物,并对LAMP反应温度和反应时间等条件进行了优化。该方法的检测限为30fgRNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与鲤春血症病毒、传染性胰脏坏死病毒、传染性造血器官坏死病毒、海洋双RNA病毒、病毒性出血败血症病毒以及病毒性神经坏死病毒等没有交叉反应。该方法检测时间短,在1h内即可完成检测。用建立的LAMP方法对临床鱼样进行了检测,结果表明40尾石鲽鱼样品中有3尾感染HRV,与病毒分离结果一致,说明LAMP方法比较适合牙鲆弹状病毒的早期及现场诊断。

摘要：为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),利用双启动寡核苷酸引物(DPO)技术,以TSWV外壳蛋白(CP)基因为靶基因,设计了一对DPO引物,对PCR反应体系中的引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶用量进行优化,建立了TSWV的DPO-PCR检测方法,并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明,应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带,与预期目标相符。经过优化后,DPO-PCR反应体系(25μL)为:DNA模板1μL,10×Buffer(含Mg2+)2.5μL,d NTPs(每种2.5 mmol/L)2.0μL,Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2μL,上、下游DPO引物(20μmol/L)各1.0μL,以去离子水补充至25μL。利用该检测方法,在49.8~70.0℃的退火温度范围内,均可实现目标基因片段的高效扩增,说明其对退火温度不敏感;利用病毒RNA进行检测,该方法的灵敏度为7.5 ng;通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明,仅TSWV呈现阳性反应,说明该方法特异性强。所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV,可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断。

摘要：目的为建立肠侵袭性大肠杆菌（EIEC）的DPO-PCR快速检测方法。方法本研究以EIECipaH基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了EIEC DPO-PCR检测方法。结果退火温度范围在47℃~67℃内都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与EIEC的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为1.17×102 cfu/mL。利用该检测方法对采集的230份样品进行检测,共计检出3份EIEC阳性样品,与国标法（GB 4789.6-2003）检测结果一致,显示了良好的实用性。结论该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性。

摘要：以副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus,VP）toxR基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸（DPO）引物,建立了DPO-PCR快速检测VP的方法.结果显示,退火温度在49～69℃都能有效地扩增出目的基因,表明该检测方法对退火温度不敏感;该DPO引物仅与VP的扩增反应呈阳性,而与其他菌株无非特异性扩增反应,表明该方法特异性强;该方法的灵敏度为121 CFU/mL.利用该检测方法对采集的550份样品进行检测,共计检出19份VP阳性样品,与行标法（SN/T 1870-2007）检测结果一致,实用性良好.该DPO-PCR方法设计简单、特异性强,具有良好的实用性.

摘要：肠出血性大肠杆菌(EHEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)和肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)是引起腹泻、危害食品安全和人类健康的4种主要大肠杆菌。本实验基于ETEC LT基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵袭性质粒基因序列,设计了4对特异性引物,利用聚合酶链反应(PCR)和变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography,DHPLC)技术,通过体系优化,建立了致腹泻性大肠杆菌多重PCR-DHPLC检测方法,达到同时检测4种致病菌的目的。该方法灵敏度高,最低检测限为EHEC6×101拷贝/μL、ETEC1.3×102拷贝/μL、EPEC9×101拷贝/μL、EIEC7×101拷贝/μL。特异性试验表明,对22种共41株细菌进行检测,所试6株致腹泻性大肠杆菌均为阳性。实践证明,该方法具有良好的实用性,可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的单一或混合感染的检测。

摘要：为了快速有效地进行具有中间水道的用水网络设计,提出了基于水夹点分析的用水网络设计方法。水夹点分析基于对用水过程中使用新鲜水或回用水的指导,获得初始中间水道浓度估计值并给出中间水道中水分配的基本规则。首先根据水夹点浓度确定中间水道杂质浓度,并对用水单元进行分组,安排用水单元在用水网络中的位置,然后优化中间水道水流量,确定最优用水网络结构。水夹点分析提供具有中间水道初始用水网络结构,降低数学优化求解的规模和难度,所提夹点设计方法简捷易行。2个实例的计算结果表明,所提出的方法比简单的夹点分析和节水因子方法可分别节水2.56%和7.58%。

摘要：为建立肠致病性大肠杆菌（EPEC）的快速检测方法,本研究以EPEC bfp A基因为靶基因设计了一对双启动寡核苷酸引物（DPO）,建立了EPEC的DPO-PCR快速检测方法。结果显示,退火温度在45℃~65℃范围内均能够高效地扩增出目的基因,表明DPO引物对退火温度不敏感。该方法对其他菌株的扩增结果均为阴性,特异性强;其灵敏度为97 cfu/m L。利用该方法和国标法分别对采集的230份临床样品进行检测,均共计检出5份EPEC阳性样品,两者符合率为100%。本研究建立的DPO-PCR方法设计简单、特异性强、灵敏度高,具有良好的实用性,为快速准确检测EPEC提供新的检测手段。