摘要：按照shRNA(small hairpin RNA)设计原则,针对Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type2,HSV-2)的UL27基因序列保守区域筛选设计、合成4条干扰靶序列并构建表达UL27序列特异性siRNA(short interfering RNA)的质粒载体pGPU6/GFP/Neo.通过脂质体介导重组表达载体转染HEK293细胞(human embryonic kidney 293 cell)再接种HSV-2.采用实时荧光定量PCR(real-timefluorescent quantitative PCR)技术检测UL27各组的mRNA转录水平,终点滴定法检测细胞上清液中的病毒滴度,四甲基偶氮唑盐(four methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法测定细胞存活率,Western印迹法检测蛋白表达效果.结果显示,UL27shRNA75组对UL27基因mRNA表达抑制效果最佳,同时能显著抑制感染细胞的CPE(cytopathic effect,CPE),降低上清液中的病毒感染滴度,提高细胞的生存率,抑制UL27基因的蛋白表达.提示本研究构建的pGPU6/GFP/Neo-UL27表达载体能在细胞水平上不同程度地干扰HSV-2 UL27基因表达,抑制HSV-2在HEK293细胞中复制.

摘要：背景:解旋酶-引发酶复合体是Ⅱ型单纯疱疹病毒进行复制的必需基因,UL5基因为Ⅱ型单纯疱疹病毒解旋酶-引发酶复合体的组成单位之一。目的:应用RNA干扰技术分析特异性小干扰RNA对Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因的干扰作用。方法:以Ⅱ型单纯疱疹病毒UL5基因为靶目标,设计、合成5对特异性小干扰RNA。通过LipofeCtamine 2000脂质体将特异性小干扰RNA转染HEK293细胞。48h后行荧光定量RT-PCR检测UL5基因转录水平,终点滴定法测定干扰后病毒滴度,观察其干扰效果。结果与结论:小干扰RNA成功转染入细胞内。荧光定量RT-PCR结果显示,siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低靶mRNA表达,病毒滴度检测结果显示siRNA722、siRNA2394、siRNA2513和siRNA2627均可不同程度降低上清液中病毒感染滴度,阴性对照组和siRNA374对病毒感染滴度无影响。针对UL5基因的有效小干扰RNA可以特异性降低Ⅱ型单纯疱疹病毒的复制水平。