摘要：目的分析枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides,LBP)对过氧化氢刺激引起的人子宫内膜间质细胞(endometrial stromal cells,ESCs)凋亡的影响以及对同源物磷酸脂酶基因(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)/蛋白激酶(protein kinase,AKT)信号通路蛋白的激活情况。方法体外培养传代人ESCs,实验设计对照组、LBP组、过氧化氢组以及治疗组共4组。对照组:常规培养液;LBP组:常规培养液+100 mg/L的LBP;过氧化氢组:常规培养液+100μmol/L的过氧化氢;治疗组:提前加入100 mg/L的LBP作用24 h,再加入100μmol/L的过氧化氢,观察细胞在形态方面的改变。细胞活力检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)分析各组细胞的存活率,流式细胞技术测量细胞的凋亡率,比色法测量4组细胞中丙二醛(malondiald ehyde,MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的活力,蛋白免疫印迹分析细胞中B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Associated X,Bax)、PTEN、AKT以及磷酸化的AKT(p-protein kinase,p-AKT)的含量。结果LBP组和对照组相比,细胞形态、存活率、凋亡率以及细胞中的Bcl-2、Bax、PTEN、p-AKT和AKT比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。过氧化氢组和正常组比较,细胞呈圆形,脱落多而贴壁少;存活率[(51.37±3.28)%]降低,而凋亡率[(53.42±2.37)%]升高;MDA含量[(4.56±0.70)mmol/L]上升而SOD活力[(9.39±0.72)U/L]下降,胞质中Bcl-2(0.148±0.020)和p-AKT(0.457±0.053)含量降低,Bax(1.076±0.036)和PTEN(0.538±0.049)含量升高(均P<0.05)。治疗组和过氧化氢组比较,细胞伸展且有短突起,脱落少而贴壁多;存活率[(87.72±4.52)%]升高,而凋亡率[(25.02±2.76)%]降低;MDA含量[(2.14±0.47)mmol/L]下降而SOD活力[(16.60±1.25)U/L]上升,胞质中Bcl-2(0.852±0.051)和p-AKT(0.942±0.095)含量上升,Bax(0.202±0.014)和PTEN(0.283±0.022)含量下降(均P<0.05)。结论LBP能明显拮抗过氧化氢刺激导致的细胞存活率降低及凋亡率升高,降低氧化应激产物,这与激活PTEN/AKT信号通路密切相关。

摘要：目的观察双氢青蒿素(DHA)对经转化生长因子-β1(TGF-β1)孵育的来源于人子宫壁的内膜组织中的间质细胞(ESCs)数目和活力的变化。方法2018年1月1日—6月1日,收集人正常的子宫内膜组织并分离出ESCs。实验设计分为4组。正常组:加入不含血清的培养液;TGF-β1组:在正常组的基础上加10 ng/mLTGF-β1;DHA组:在正常组的基础上加100 ng/mLDHA;TGF-β1+DHA组:在TGF-β1组的基础上加100 ng/mLDHA。通过噻唑蓝法检测每组细胞的增殖变化;用酶联免疫吸附(ELISA)法判定每组细胞孵育液中Ⅰ型胶原和纤黏连蛋白的水平。免疫印迹(Western blot)评估胞质内的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的含量。结果正常组和DHA组之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);与正常组相比,TGF-β1组的ESCs数目增加,细胞分泌Ⅰ型胶原[(0.7334±0.0073)ng/L]与纤黏连蛋白[(0.6834±0.0081)ng/L]的量增多,细胞内MMP-9含量(0.471±0.030)降低,然而TIMP-1的含量(0.692±0.010)升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);与TGF-β1组相比,TGF-β1+DHA组的ESCs数目减少,细胞分泌Ⅰ型胶原[(0.6543±0.0101)ng/L]和纤黏连蛋白[(0.5549±0.0092)ng/L]的量降低,细胞内MMP-9含量(0.593±0.026)升高,而TIMP-1含量(0.543±0.013)降低,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论ESCs在TGF-β1的作用下数目增多且分泌功能活跃,而DHA能抑制TGF-β1对子宫内膜间质细胞的这种作用。

摘要：目的研究人经血干细胞(MenSCs)接种到宫腔黏连组织表面,观察子宫内膜组织的结构变化,内膜组织中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及钙粘蛋白E含量变化,探索MenSCs接种改善宫腔黏连的机制。方法利用大鼠采用人为方法制造宫腔黏连模型,实验设计为对照组、模型组和MenSCs组,每组6只,共18只。比较3组内膜组织的结构改变和内膜组织中腺管的个数;Masson组织染色比较内膜组织的纤维化面积百分比;免疫印迹技术分析α-SMA、TGF-β1及钙粘蛋白E的蛋白条带的灰度值。结果与对照组比较,模型组内膜组织无上皮组织覆盖,只见结构增厚且无腺体的结缔组织,所含的纤维化面积[(0.70±0.05)%]较多(P<0.05),α-SMA(0.468±0.037)和TGF-β1(0.485±0.029)升高(P<0.05),钙粘蛋白E(0.242±0.021)降低(P<0.05)。与模型组比较,MenSCs组显示出现新生的上皮组织,腺体个数增加[(5.47±0.31)个],纤维化面积[(0.49±0.05)%]减少(P<0.05),α-SMA(0.370±0.025)和TGF-β1(0.387±0.016)降低(P<0.05),钙粘蛋白E(0.431±0.014)升高(P<0.05)。结论MenSCs接种到宫腔黏连组织表面后,能分化为子宫内膜上皮细胞,并能降低宫腔粘连组织中的α-SMA和TGF-β1蛋白含量,升高钙粘蛋白E的含量来改善宫腔黏连状况。

摘要：目的:探讨使用CRSIPR/Cas9技术删除CTL的免疫检查点CTLA-4后CTL的抗裸鼠结肠癌移植瘤的效果及其作用机制。方法:针对CTLA-4设计特异性小向导RNA(small guide RNA,sgRNA)并构建sgRNA/Cas9质粒,使用慢病毒载体转染质粒至CTL获得删除CTLA-4的CTL(CTLA-4 KO CTL),并验证质粒的转染效率和CTLA-4的删除效率。BALB/c裸鼠随机分为2组进行实验,预防性注射CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组),3 d后接种结肠癌细胞株LS174-T,观察成瘤率及成瘤时间。建立结肠癌移植瘤裸鼠模型,成瘤后裸鼠随机分为2组,分别给予CTLA-4 KO CTL(实验组)及CTL(对照组)进行细胞治疗,观察移植瘤的体积、裸鼠的生存时间,并检测移植瘤裸鼠血清中TNF-α及IFN-γ分泌水平。结果:设计sgRNA并成功构建以慢病毒为载体的CRSIPR/Cas9系统,使用构建好的CRSIPR/Cas9系统转染CTL细胞,转染效率最高可达(28.80±0.62)%,转染后以流式细胞术检测CTLA-4的删除效率,CTLA-4 KO CTL组的CTLA-4表达较CTL组显著降低[(0.91±0.25)%vs(42.70±2.72)%,P<0.01]。预防实验中,实验组结肠癌移植瘤发生率明显低于对照组(33.33%vs 100.00%,P<0.01)。治疗实验中,实验组肿瘤体积较对照组显著减少[(503.0±23.9)vs(911.2±51.4)mm^3,P<0.05],实验组裸鼠相较于对照组生存时间明显延长(中位生存期:78 vs 42 d,P<0.05),实验组裸鼠血清TNF-α[(268.93±17.04)vs(148.26±20.07)pg/ml,P<0.05]及IFN-γ[(315.38±18.67)vs (202.92±29.32) pg/ml,P<0.05]的分泌水平较对照组明显增高。结论:以CRSIPR/Cas9技术成功删除CTL中免疫检查点CTLA-4后可以显著抑制裸鼠结肠癌移植瘤的成瘤率、增强CTL对荷结肠癌裸鼠的抗肿瘤作用,并明显增高荷瘤鼠血清中TNF-α和IFN-γ水平。