摘要：根据猪α1干扰素(pocine interferon-alpha1,poIFN-α1)的全基因序列(EU364896)设计合成1对特异引物,通过RT-PCR从三元杂交仔猪外周血淋巴细胞扩增出poIFN-α1全基因,将该基因克隆到pGEM-T载体,构建重组质粒pGEM-T-poIFN-α1,进行测序。以pGEM-T-poIFN-α1为模板,经PCR扩增带有酶切位点的poIFN-α1基因,将其定向克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中,构建重组表达载体pGEX-6P-poIFNα1,转化大肠杆菌BL21(DE3)进行蛋白诱导表达和鉴定,并确定蛋白最佳表达条件。序列分析表明,克隆的poIFN-α1基因全长546bp,编码181个氨基酸,前23个氨基酸组成信号肽,无糖基化位点。SDS-PAGE和Western blotting证实重组表达菌经IPTG诱导后,可表达相对分子质量约46ku的融合蛋白(GST-poIFN-α1)。当以1.0mmol/L的IPTG于37℃下诱导表达9h时,蛋白表达量最高。poIFN-α1基因的克隆与表达为进一步研究其抗病毒活性,开发病毒治疗和疫苗免疫增强用生物制剂奠定了基础。

摘要：本研究建立了一种猪圆环病毒3型(PCV3)的快速检测方法。该方法设计了一对特异性引物,利用PCR技术对目的基因进行扩增,并进行测序验证,同时进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验,最后利用建立的猪圆环病毒3型PCR检测方法对临床送检的157份病料进行检测。结果显示,本研究所建立的PCR检测方法能特异性扩增出目的片段,长度为418 bp;测序结果和特异性试验结果表明,该方法特异性强,仅扩增出猪圆环病毒3型阳性样品,且具有较好的敏感性,能够扩增的最低模板量为1.13×10^(-3)ng/μL。用该方法对157份病料进行检测,结果显示,猪圆环病毒3型的阳性率为15.92%。PCV3与PCV2的混合感染率为5.73%,而PCV3与PRV不存在交叉感染。本研究建立的PCR方法具有良好的特异性和敏感性,临床应用效果好,可用于猪圆环病毒3型的快速检测和流行病学调查。对PCV3流行病学的研究将有助于了解其致病特性并制定有效防控手段,同时也为PCV2与PCV3混合感染问题的解决提供了理论基础。

摘要：本研究针对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的开放阅读框7(orf7)序列设计扩增引物,建立R T-PCR检测方法,既可检测出高致病性蓝耳病,也可检测出蓝耳病经典毒株,提高了蓝耳病的检出率。

摘要：猪伪狂犬病病毒g E基因缺失疫苗已得到世界各地养殖户的普遍认可,使用范围较广。为建立一种快速区别疫苗毒和野毒的检测方法,本试验针对PRV的g E基因序列设计引物。经过各种条件的不断摸索优化,建立了一套敏感度较高、特异性较好的反应体系,适用于临床诊断、流行病学调查及科学研究,对确诊猪伪狂犬病有重要意义。

摘要：根据绵羊朊蛋白基因(prion protein nucleic acid,PrNP)序列,截去PrNP部分N端信号肽(150 bp)和C端GPI锚定位点(123 bp)形成PrNPT-08,设计特异性引物,以绵羊全血提取DNA为模板,扩增PrNPT-08序列。与表达载体pET30a(+)连接,转化入BL21(DE3)感受态细胞。用IPTG诱导表达,其产物经SDS-PAGE电泳、纯化、Western blotting验证。结果表明,所插入的克隆片段含有498个核苷酸,共编码166个氨基酸,序列对比分析表明,与GenBank中绵羊朊蛋白基因序列同源性为99.6%,氨基酸序列同源性为98.8%。PrNP T-08基因在大肠杆菌得到高效表达,表达产物为相对分子量为27 kDa的融合蛋白,并能被PrP单克隆抗体AH6所识别。该蛋白成功表达为研究朊蛋白生理生化功能和结构转变提供了基础生物学材料,同时为朊蛋白疾病诊断中所需单克隆抗体的制备提供基本的试验材料。

摘要：为能够用实时荧光定量PCR检测PrP106-126作用的鼠巨噬细胞细胞因子的表达水平,构建目的基因IL-1β、TNF-α、IL-6和内参基因β-actin的标准品质粒和标准曲线。根据GenBank中鼠基因编码区保守序列,设计特异性引物;细胞经PrP106-126作用后,提取总RNA。经反转录、PCR扩增、纯化、连接和转化后,提取质粒并测序鉴定,获得IL-1β、TNFα-、IL-6和β-actin质粒;将质粒梯度稀释,进行荧光定量PCR,获得标准曲线及回归方程。结果显示,产物溶解曲线峰值单一,引物特异性高;标准曲线相关系数r2=0.999,表明线性关系好,成功构建了目的基因和内参基因的标准品质粒和标准曲线。