摘要：病理生理学实验教学与临床结合有利于培养学生的动手能力和临床思维能力,加深对疾病发生机制的理解。病理生理实验教学通过开展实验设计、巧妙设立问题、典型病例分析与临床结合,激发学生兴趣,为临床教学打下基础。

摘要：目的：建立过量表达食管癌突变型（点突变型和缺失突变型）DNA聚合酶β（DNA Polymeraseβ，polβ）的EC9706细胞系，并观察其生物学特性的变化。方法：根据GenBank DNA polβ的eDNA序列设计引物，运用PCR方法，从质粒peDNA3．1-polβ中扩增出点突变和缺失突变型的DNA polβ基因，作为目的片段，定向克隆至pEGFP—N3真核绿色荧光蛋白表达载体，获得点突变和缺失突变型的重组真核表达载体pEGFP—N3-polβ。采用脂质体转染的方法，将两种突变型的pEGFP—N3-polβ转染EC9706细胞系，荧光倒置显微镜观察其细胞定位，绘制生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期。结果：成功构建了点突变型和缺失突变型pEGFP—N3-polβ重组真核表达载体，荧光倒置显微镜结果显示缺失突变型的DNA polβ表达以细胞胞浆为主，点突变型以细胞胞核为主，而且缺失突变型的细胞生长较对照组明显减慢（P〈0．05），点突变型与对照组相比则无明显差异（P〉0．05）；缺失突变型的DNA polβ还可使EC9706细胞的S期细胞明显减少（P〈0．05），而点突变型轻度减少（P〈0．05）。结论：成功建立了稳定高表达人点突变型和缺失突变型DNA polβ的EC9706细胞系，外源点突变型和缺失突变型DNA polβ在食管癌EC9706细胞表达后可以改变其生物学特性，对研究食管癌的发病机制具有重要意义。

摘要：目的 :观察巨噬细胞 (Mφ)与树突状细胞 (dendriticcell,DC)对H2 2肝细胞瘤、CT2 6结肠腺癌小鼠协同抗肿瘤免疫作用。方法 :腹腔荷H2 2 (1× 10 6)昆明鼠随机均分成 :①H2 2组、②H2 2 +Mφ组、③H2 2 +DC组、④H2 2 +Mφ +DC组 ,按组别腹腔分别注入Mφ和 (或 )H2 2脉冲致敏DC ;腹腔荷CT2 6 (1× 10 4)BALB/C小鼠以双向有序二因素检测 (9格方格表 )设计 ,治疗鼠同时注射相应数量的Mφ和CT2 6脉冲致敏DC ,每鼠的Mφ和DC呈不同组合。 1周后均强化 1次 ,所注入数量同第 1次。结果 :H2 2组小鼠 38d内均死亡 ,死亡的中位时间为 2 9d ;而H2 2 +Mφ组和H2 2 +DC组均死亡 3只 ,死亡的中位时间分别为 37d ,36d ;H2 2 +Mφ +DC组在实验观察 6 0d内 ,未出现腹水 ,无一死亡 ;荷瘤一段时间后 ,前 3组小鼠静脉血粒细胞 /淋巴细胞比值进行性增大 ,免疫细胞数量减少。荷CT2 6小鼠生存时间行免疫治疗比未免疫治疗延长 ,单用DC或Mφ呈疗效 剂量依赖性 ,高剂量Mφ和DC合用与DC或Mφ单用疗效差异无显著性。结论 :DC、Mφ细胞均能提高机体抗瘤能力和生存期 ,有明确的量效关系 ;DC抗原递呈功能明显大于Mφ ;DC。

摘要：目的:构建DNA聚合酶β(polβ)靶向的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体。方法:根据GenBank中人DNApolβ基因(M13140)的全长序列,利用设计分析软件设计2个DNApolβ靶向发卡样siRNA结构,退火后形成双链,克隆入表达载体pslience2.0-GFP,得到重组质粒pslience2.0-GFP-sipolβ1和pslience2.0-GFP-sipolβ2。通过限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定对重组质粒进行鉴定。结果:经酶切鉴定寡核苷酸已成功插入表达载体pslience2.0-GFP,DNA序列分析表明插入片段序列与合成的siRNA序列相同。结论:成功构建了靶向DNApolβsiRNA真核表达载体。

摘要：目的:构建带新霉素抗性的萤光素酶报告载体。方法:设计扩增新霉素抗性基因neo,克隆入萤光素酶报告载体pGL3,得到pGL3-neo。分别比较pGL3、pGL3-CMV promoter瞬时转染组和经G418筛选的pGL3-neo、pGL3-neo-CMV promoter稳定转染组细胞萤光素酶活性。结果:PCR扩增出neo表达单元;酶切和DNA测序分析鉴定得到带新霉素抗性的萤光素酶报告质粒pGL3-neo。G418筛选可获得稳定转染pGL3-neo细胞株和稳定转染pGL3-neo-CMV promoter的细胞株。荧光检测显示:瞬时转染pGL3组、pGL3-CMVpromoter组及稳定转染pGL3-neo组、pGL3-neo-CMVpromoter组萤光素酶活性值分别为1047±86、1504±107和34819±1479、456109±15791,稳定转染组萤光素酶活性均高于瞬时转染组,P<0.05。结论:成功构建了带新霉素抗性的萤光素酶报告基因载体,使报告基因检测数据的敏感性和可靠性显著提高。

摘要：目的:应用RNA干扰技术,构建针对CEA的siRNA载体,抑制人食管癌EC9706细胞CEA基因的表达.方法:依据设计siRNA的原则,针对人CEA的mRNA序列,设计并合成编码siRNA的两对寡核苷酸序列,经退火成互补双链,克隆入载体pRNAT-U6.2中构建重组体pRNAT-U6.2-CEA,筛选、鉴定.然后转染重组体至人食管癌EC9706细胞中,经G418筛选,获得阳性克隆,并以空质粒转染和未进行转染的EC9706作对照,运用PCR和Western Blot检测CEA的表达.结果:测序鉴定证实目的寡核苷酸片断已被克隆到pRNAT-U6.2载体中,pRNAT-U6.2-CEA转染人食管癌EC9706细胞后,CEA基因表达在mRNA和蛋白质水平都受到显著抑制.结论:成功构建了针对人食管癌EC9706细胞的siRNA载体,可有效抑制CEA的表达,为进一步从分子水平探讨CEA的功能奠定了基础.

摘要：目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。

摘要：目的:构建同时沉默Livin基因和MTA1基因的小干扰RNA(siRNA)载体。方法:设计Livin和MTA1的siRNA靶序列,合成它们互补的寡核苷酸链,分别退火后重组入pRNAT-U6.2载体,得到pRNAT-U6.2-Livin和pR-NAT-U6.2-MTA1。AccⅡ和XhoⅠ酶切pRNAT-U6.2-MTA1,回收475bp的MTA1siRNA单元,然后与XhoⅠ和PmeⅠ酶切线形化的pRNAT-U6.2-Livin重组,得到pRNAT-U6.2-Livin-MTA1,后者用脂质体包被转染人食管癌细胞EC9706,采用RT-PCR法分别检测转染细胞Livin和MTA1基因mRNA的表达情况。结果:针对Livin基因和MTA1基因的siRNA的双链寡核苷酸片段分别克隆入pRNAT-U6.2载体,经测序分析插入片段正确。PCR扩增证实MTA1siRNA单元重组入pRNAT-U6.2-Livin。RT-PCR检测显示,转染pRNAT-U6.2-Livin-MTA1的EC9706细胞Livin基因和MTA1基因mRNA表达水平皆明显降低。结论:同时沉默Livin基因和MTA1基因表达的siRNA载体构建成功。

摘要：目的利用RNA干扰(RNAi)技术,以人组织因子(TF)基因为靶基因,构建特异性的RNA干扰真核细胞表达载体。方法根据GenBank提供的人TF基因的核苷酸序列,设计具有小发夹结构的2条DNA序列,经退火后成为互补双链,然后将其克隆至干扰载体pSUPER质粒中,转化DH5α菌株,提取质粒行酶切鉴定,最后进行DNA测序。结果构建成功的针对人TF基因的RNA干扰真核表达载体,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计序列完全一致。结论成功构建了针对人TF基因的真核载体,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新方法。

摘要：目的构建含食管癌突变型DNA聚合酶β基因(DNA polymeraseβ,polβ)的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,使其在polβ基因敲除的EC9706细胞中表达。方法根据食管癌突变型polβ基因序列,设计并合成一对特异性引物(引物1、引物2),通过PCR扩增获得含BamHⅠ和ApaⅠ的基因序列,将其克隆入T载体,PCR及测序鉴定无误后,将其插入真核表达载体pcD-NA4-C,从而构建了含突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ。将重组质粒以脂质体包裹的方式转染入polβ基因敲除的EC 9706细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株。结果经过PCR筛选及DNA测序鉴定,证实真核表达载体pcDNA4-C-polβ构建成功。筛选后的EC 9706细胞经HislinkTM蛋白纯化试剂盒纯化,仅在39kD位置有一条带,证明蛋白表达及纯化成功。结论成功构建了食管癌突变型polβ基因的真核表达载体pcDNA4-C-polβ,并纯化出polβ蛋白,为进一步研究polβ的功能奠定坚实的基础。