摘要：目的构建针对核干细胞因子(NS)基因的小干扰RNA(siRNA)真核表达载体。方法根据GenBank提供的NS基因AY825265mRNA序列及siRNA设计原则设计siRNA,筛选得到126-144nt,199-217nt和487-505nt3个19bp片段为靶序列;合成带有BamHI、XhoI酶切位点的发夹结构寡核苷酸序列,经过退火,将此序列克隆至载体pRNAT-U6.1中构建重组表达载体;转化DH5α,提取质粒,应用PCR技术和测序方法鉴定重组克隆。转染入食管癌EC9706细胞,检测NS基因沉默情况。结果PCR筛选得到3个目的片段的阳性重组克隆,测序证实重组表达载体中插入序列与设计一致。RT-PCR和Westernblot检测显示构建的siRNA表达载体可显著降低EC9706细胞中NSmRNA和蛋白水平的表达。结论成功构建出一组针对NS基因的siRNA表达载体,为下一步NS基因的RNA干扰研究鉴定了基础。

摘要：目的研究小分子干扰RNA(siRNA)逆转胃癌多药耐药细胞亚系SGC7901/VCR mdr1介导的多药耐药效应。方法根据mdr1cDNA已知序列,设计并体外转录2条含21个核苷酸的siRNA(mdr1si2631和mdr1si3071),转染SGC7901/VCR细胞,用RT-PCR检测mdr1基因mRNA的表达,免疫组织化学检测P-gp的表达,流式细胞仪检测阿霉素在细胞内的蓄积,MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性。结果siRNA转染SGC7901/VCR细胞48 h后,mdr1基因mRNA和P-gp的表达水平下降,细胞内阿霉素积累量增加,对阿霉素敏感性的相对逆转率各达79.59%及59.98%。结论siRNA可逆转SGC7901/VCR细胞mdr1介导的多药耐药。

摘要：目的探讨再生蛋白I(RegⅠ)在胃泌素刺激胃癌细胞增殖通路中的作用。方法根据RegⅠcDNA已知序列,在线设计3个小干扰RNA,并经基因库同源性比较,构建其RegⅠ-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-REG/1、pSUPER-EGFP-REG/2和pSUPER-EGFP-REG/3),利用脂质体2000转染试剂分别转染胃癌细胞BGC823细胞株、SGC7901细胞株,同时设转染空质粒的实验对照组和无质粒转染的空白细胞组。后经G418筛选建立稳定转染细胞株。RT-PCR检测RegⅠ基因mRNA的转录水平,四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测胃泌素孵育对胃癌细胞增殖的效应。结果酶切及测序鉴定,插入片段正确,3个RegⅠ-shRNA表达载体构建成功;RT-PCR显示,pSUPER-EGFP-REG/1可有效抑制RegⅠmRNA在胃癌细胞BGC823、SGC7901的转录。Western boltting结果显示,BGC823和SGC7901细胞的RegⅠ蛋白表达率分别下调到空载体对照组的(45±4)%和(53±4)%;MTT结果显示,RegⅠ基因表达抑制胃癌细胞系的增殖效率均降低(P0.05)。结论实验成功建立了RegⅠ基因表达抑制的胃癌细胞系;RegⅠ基因可能对胃泌素促胃癌细胞的增殖有促进的作用。

摘要：目的构建针对葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA的siRNA表达载体,并观察其对转染细胞中GCS表达的影响。方法根据人GCSmRNA编码序列,设计并合成3对针对GCS的发卡状RNA的寡核苷酸,各64个碱基,退火后插入pSUPEREGFP载体重组构建RNAi质粒,进行双酶切及测序鉴定。重组质粒用脂质体包裹转染入SGC7901/VCR细胞,采用RT-PCR检测GCSmRNA表达水平的变化。结果重组构建的载体经酶切鉴定与测序分析,显示特定位点靶序列与设计序列完全一致。转染SGC7901/VCR细胞后,GCSmRNA表达明显降低。结论GCSsiRNA表达载体构建成功,并可有效抑制人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞中GCS的表达,为后续研究及肿瘤的基因治疗奠定了基础。

摘要：目的:检测全反式维甲酸(ATRA)诱导后HL-60细胞核干细胞因子(NS)mRNA表达的变化,探讨NS mRNA表达与细胞分化之间的关系。方法:从NS基因的3个变异体中筛选出共同序列设计特异性引物,用终浓度为0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L的ATRA诱导分化HL-60白血病细胞48h,以不加ATRA的HL-60细胞作为对照,应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测HL-60细胞NS mRNA表达水平的变化。结果:ATRA诱导HL-60细胞分化后NS mRNA表达均有所降低,0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L浓度下NS mRNA表达量分别下降3.72%±0.84%、58.70%±4.98%和61.60%±2.26%。其中1μmol/L和10μmol/L组与对照组和0.1μmol/L组比较,差异均有统计学意义(P均<0.05)。结论:NS可能与白血病细胞分化有关,参与调控细胞分化过程。

摘要：目的探讨ZAC基因在生长抑素类似物奥曲肽(OCT)抑制胃癌细胞增殖通路的作用。方法分别以不同浓度OCT处理胃癌细胞BGC823和SGC7901不同时间,MTT法筛选其增殖抑制的有效条件。OCT处理胃癌细胞(有效浓度/不同时间,有效时间/不同浓度),Western blotting检测OCT对胃癌细胞ZAC基因的效应。设计3条ZAC基因RNA干扰片段,分别插入pSUPER-EGFP-I载体,构建3个ZAC-shRNA表达载体(pSUPER-EGFP-ZAC/1、pSUPER-EGFP-ZAC/2和pSUPER-EGFP-ZAC/3)。经酶切和序列分析鉴定后,分别转染胃癌细胞BGC823和SGC7901。经G418筛选,RT-PCR鉴定,建立ZAC基因敲低(knock-down)的胃癌细胞系。以有效条件OCT孵育胃癌细胞(对照组)和ZAC基因敲低胃癌细胞(实验组),MTT法检测OCT对胃癌细胞的生长抑制效应。结果OCT抑制胃癌细胞增殖的有效条件为10nmol/L孵育24h;OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达。酶切及序列分析鉴定表明ZAC-shRNA表达载体构建成功。转染shRNA-ZAC/2的胃癌细胞,其ZAC mRNA水平明显降低(P0.05)。结论 OCT以时间和浓度依赖的方式诱导胃癌细胞ZAC基因表达;ZAC基因在OCT抑制胃癌细胞增殖通路中具有重要作用。

摘要：目的:探讨10-23脱氧核酶(10-23DRz)抑制CTX-M-38型ESBLs的可行性。方法:依据CTX-M-38型ESBLs序列及其mRNA构象特征,设计针对其mRNA结构的10-23DRz脱氧核酸序列及反义核酸序列;采用氯化钙法对10-23DRz及反义核酸进行转化;依据转化菌在平板上菌落形成状况及菌液吸光度选择10-23DRz应用量;采用K-B法体外药敏试验检测耐药活性。结果:45nmol10-23DRz用量时转化菌菌落形成量及菌液吸光度较为理想。除哌拉西林、头孢噻肟及亚胺培南外,其他抗菌药物10-23DRz组与反义核酸组抑菌环直径间差异有统计学意义(P均<0.001)。结论:10-23DRz可抑制CTX-M-38型ESBLs的表达。