摘要：目的:克隆杜氏盐藻糖原合成酶激酶3(GSK3)基因序列并探讨它在鞭毛再生中的作用。方法:根据杜氏盐藻转录组测序得到的GSK3的2个片段设计上下游引物,提取盐藻总RNA进行RT-PCR,以此为模板扩增2个片段之间的序列。采用3'RACE方法扩增杜氏盐藻GSK3基因3'端序列,通过杜氏盐藻消减杂交模板扩增得到5'端序列。采用pH休克法去除杜氏盐藻鞭毛,通过实时荧光定量PCR观察鞭毛再生过程中GSK3基因在转录水平上的变化。结果:获得一段长为2116bp的GSK3 cDNA片段,其中包含737bp的3'UTR和1158bp的开放阅读框。实时荧光定量PCR结果表明,GSK3的mRNA转录水平在鞭毛再生过程中明显升高。结论:杜氏盐藻GSK3基因与鞭毛再生密切相关。

摘要：目的:克隆杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白(IFT)88的cDNA全长并分析其部分功能。方法:根据盐藻转录组测序片段,分别设计其3'端内、外侧引物及5'端内、外侧引物,PCR扩增其全长。提取盐藻再生过程中不同时间段的总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR,检测IFT88 mRNA的表达情况。随后利用ORF finder预测并扩增其开放阅读框,连接到pET28a载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在1mmol/LIPTG、37℃的条件下诱导4h,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测IFT88蛋白表达情况。结果:克隆拼接后共得到开放阅读框2400bp,编码799个氨基酸。BLAST显示该氨基酸序列与多个物种的IFT88有较高同源性。SDS-PAGE结果显示,与未诱导组相比,诱导组在90000左右有一条明显的条带。在鞭毛再生过程中,杜氏盐藻IFT88 mRNA的表达量在去鞭毛后30min左右时最高,随后快速下降。结论:扩增得到杜氏盐藻IFT88 cDNA序列且IFT88可能参与盐藻鞭毛组装。

摘要：目的:构建包含Notch1胞内结构域的Notch1-NICD真核表达载体及绿色荧光蛋白载体并转染食管鳞状细胞癌细胞株EC9706及Eca109,并对Notch1-NICD1在食管鳞状细胞癌中的功能进行初步探索。方法:根据GenBank上的Notch1-NICD序列设计扩增引物,由RT-PCR扩增NICD片段,测序鉴定,并通过Blast进行序列比对,然后回收目的片段并与真核表达载体pcDNA3.1(+)相连,构建Notch1-NICD真核表达载体pNotch1-NICD1,同时将扩增的NICD与pEGFP-C1载体相连构建绿色荧光蛋白表达载体pENotch1-NICD1,并转染EC9706及Eca109,观察Notch1在细胞中的定位及其途径的激活状态。同时将pNotch1-NICD1真核表达载体转染EC9706及Eca109,用MTT法分别在24h、48h、72h、96h及120h观察外源性Notch1片段的导入对EC9706及Eca109细胞增殖的影响。结果:通过RT-PCR获得1个Notch1胞内区片段,并成功构建了包含Notch1胞内区结构域的绿色荧光蛋白载体及真核表达载体。转染pENotch1-NICD1后,Notch1在胞质和胞核内均有表达,表明Notch1信号通路被激活。此外,MTT结果表明转染Notch1-NICD1片段的食管鳞状细胞癌细胞的增殖受到明显抑制(P<0.05)。结论:成功构建了Notch1绿色荧光蛋白表达载体及pcDNA3.1(+)真核表达载体。外源Notch1片段的引入能够明显抑制食管鳞状细胞癌细胞的增殖,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞状细胞癌的一个潜在的分子靶点。

摘要：根据莱因衣藻、卵形肾藻、普通小球藻等10种藻类的atpA全基因氨基酸高度保守序列,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增出约400bp的片段,将该片段连接到T-vector上进行序列测定。结果表明,核苷酸长度为405bp,编码135个氨基酸。推导的氨基酸序列与莱因衣藻的同源性为92%,普通小球藻88%,Mesostigmaviride87%,卵形肾藻86%,Cyanidioschyzonmerolae85%。以所克隆的DNA片段为探针,与盐藻叶绿体基因组进行SouthernBlot杂交结果有明显的杂交信号。据此可推断本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。该基因序列已被GenBank收录,接受号为AY435096。

摘要：目的:观察核糖体40s小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)特异性短发夹RNA(shRNA)对EC9706细胞p70S6K表达的影响。方法:根据GenBank p70S6K的mRNA序列,设计并合成p70S6K特异性的shRNA序列,退火形成双链后插入pSIREN-RetroQ-DsRed-Express载体,构建表达载体pshRNA-p70S6K,转染EC9706细胞。采用RT-PCR和Western blot方法分别检测转染24、48、72、96及120h后细胞中p70S6K mRNA和磷酸化p70S6K的表达,设未转染的EC9706细胞为对照。结果:各组细胞p70S6K mRNA和磷酸化p70S6K蛋白的表达差异有统计学意义(F=106.343,721.632,P均<0.001)。转染细胞p70S6K mRNA的表达在转染24、48和72h后均较对照组下降(P<0.05),在第48h表达最低;磷酸化p70S6K蛋白的表达在转染24、48、72和96h后均较对照组下降(P<0.05),第48h表达最低。结论:p70S6K特异性shRNA能够下调EC9706细胞中p70S6K mRNA和蛋白的表达。

摘要：目的:扩增人胎盘组织Notch1基因C端特征性结构域ANK和NLS(简称AN),并构建pcDNA3.1-AN真核表达载体。方法:按照GenBank中Notch1序列,设计一对引物,利用RT-PCR方法从人胎盘组织中获取ANcDNA片段,将其克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达载体pcDNA3.1-AN。结果:所获得的序列是Notch1特征性的AN结构域。结论:成功构建了pcDNA3.1-AN真核表达载体。

摘要：根据玉米，水稻等物种泛素序列设计一对简并引物。提取杜氏盐藻细胞的总RNA，利用RT-PCR方法扩增盐藻泛素基因的cDNA片断，回收两个长度不同的片断ubi-1和ubi-2，将其克隆到pMD18-T载体上，测序后进行序列分析，为克隆杜氏盐藻泛素基因的cDNA序列并进行进化分析。结果ubi-1经测序后得到一个完整拷贝（228bp）和一个不完整的泛素cDNA序列（191bp）。Ubi-2经测序后得到两个拷贝（556bp）和一个不完整的泛素cDNA序列（191bp）。盐藻3个不同拷贝泛素cDNA序列之间存在差异，但所编码氨基酸序列相同。盐藻泛素cDNA序列与其他物种的泛素cDNA序列具有高的同源（70％～85％），所推导的氨基酸序列与其他物种仅存在1～2个氨基酸的差异。进化分析显示，所分离的盐藻泛素基因与两个模式生物果蝇和衣藻的泛素基因共处一个进化支．彼此亲缘关系最近。盐藻泛素基因与其他物种的泛素基因可能来自共同的“祖先”基因，在进化中高度保守。