摘要：目的观察骨肉瘤组织和细胞株中环状RNA circ000880表达, 及其对骨肉瘤细胞增殖的影响。方法选取经病理确诊的骨肉瘤的标本共16例, 采用circRNA高通量测序技术检测表达差异的circRNA。提取骨肉瘤及其癌旁组织总RNA, 依据circ000880序列, 设计divergent primer, 扩增包含backsplice junction区域片段, 随后连接入pGM-T载体进行测序鉴定。采用SYBR Green荧光定量PCR, 分别检测骨肉瘤及其癌旁组织, 骨肉瘤细胞MG63、SAOS-2、U2OS及正常人成骨细胞hFOB1.19中circ000880的表达水平。将circ000880小干扰RNA(siRNA)和circ000880 NC慢病毒转染至骨肉瘤细胞后检测细胞中circ000880的表达水平, 并通过细胞计数试剂盒(CCK-8)及克隆形成实验检测对骨肉瘤细胞增殖的影响。两样本两组间比较用t检验。结果采用circRNA高通量测序技术检测结果显示骨肉瘤组织及细胞中circ000880的表达显著上调, 并通过测序鉴定证实circ000880在骨肉瘤组织中存在、且为环状RNA。反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示circ000880在骨肉瘤组织中的表达量(2.032±0.165)显著高于其癌旁组织(1.105±0.155, t=16.393, P<0.05)。circ00088在骨肉瘤细胞系MG63(2.252±0.140)、SAOS-2(2.134±0.176)、U2OS(2.011±0.226)中表达量均显著高于正常人成骨细胞(1.000±0.092, F=71.299, P<0.05)。转染circ000880 siRNA的MG63细胞中circ000880表达量明显下降(0.646±0.058), 转染circ000880 NC的MG63细胞中circ000880表达水平(1.005±0.121)与空白组(1.000±0.201)比较差异无统计学意义(F=17.977, P<0.05)。CCK-8及克隆形成试验结果显示, 与空白组和阴性对照组比较, 转染circ000880 siRNA的骨肉瘤细胞增殖能力显著受到抑制。结论骨肉瘤组织及细胞中circ000880表达显著上调, 敲低circ000880表达可显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力。

摘要：目的克隆骨形态发生蛋白-2（BMP-2）基因，并构建重组BMP-2基因真核表达质粒。方法从兔骨髓细胞中分离提取BMP-2的mRNA，RT-PCR扩增后，克隆入pGEM—T载体，PCR鉴定重组子；酶切下目的基因BMP-2。再亚克隆人载体pEGFP—C3质粒，酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。结果经过RT—PCR扩增得到BMP-2 cDNA条带；PCR扩增鉴定得到pGEM-T—BMP-2。酶切鉴定得到亚克隆重组子pEGFP—C3-BMP-2，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论成功克隆兔BMP-2基因，构建出重组真核表达载体BMP-2，为进一步采用BMP-2基因治疗关节软骨缺损奠定了实验基础。

摘要：背景:通过基因转移方法研究某一外源性基因在细胞中的作用是目前分子生物学常用的技术手段,与病毒载体相比,应用pcDNA4.0-TGF-β1真核表达质粒的转染方法无遗传毒性和细胞毒性,有更高的安全性。目的:通过克隆转化生长因子β1基因,观察构建重组转化生长因子β1基因真核表达质粒的可行性。设计、时间及地点:以细胞为观察对象的体外实验,于2007-03/2008-02在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。材料:2月龄清洁级健康SD大鼠,雌雄不拘,用于分离细胞中RNA。方法:从大鼠骨髓细胞中分离提取转化生长因子β1的mRNA,反转录-聚合酶链反应扩增后,克隆入pGEM-T载体,PCR鉴定重组子;酶切下目的基因转化生长因子β1,再亚克隆入载体pcDNA4.0质粒,酶切鉴定亚克隆重组子并进行DNA序列分析。主要观察指标:TGF-β1cDNA、pGEM-T-TGF-β1和重组子pcDNA4.0-TGF-β1的表达。结果:经过反转录-聚合酶链反应扩增得到TGF-β1cDNA条带;PCR扩增鉴定得到pGEM-T-TGF-β1。酶切鉴定得到亚克隆重组子pcDNA4.0-TGF-β1,经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论:成功克隆大鼠转化生长因子β1基因,并构建出重组转化生长因子β1真核表达载体。

摘要：目的研究慢病毒介导的髓细胞白血病基因(Mcl-1)短发夹状RNA(shRNA)干扰对淋巴瘤细胞系SNK-6增殖和凋亡的影响。方法设计以Mcl-1为靶点的shRNA并构建携带此shRNA的慢病毒载体,转染淋巴瘤细胞系SNK-6,荧光定量PCR(qPCR)及Western blot方法检测病毒感染前后Mcl-1 mRNA及蛋白表达变化,四甲基偶氮唑盐法(MTT法)和流式细胞仪分析细胞增殖和凋亡变化的情况。结果成功构建Mcl-1-shRNA慢病毒表达载体,并可有效感染淋巴瘤细胞株SNK-6,感染后SNK-6细胞Mcl-1基因的mRNA水平及蛋白水平表达明显下调,MTT法检测显示慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰与对照病毒组相比可明显抑制SNK-6细胞增殖[(31.6±3.3)%vs(5.8±2.7)%,P<0.01],流式细胞仪测定感染后细胞凋亡明显高于对照病毒组[(28.9±2.1)%vs(5.3±1.5)%,P<0.01]。结论慢病毒介导的Mcl-1基因shRNA干扰技术可特异性阻断SNK-6细胞Mcl-1基因的表达,抑制细胞的增殖并促进细胞的凋亡。

摘要：目的构建、鉴定靶向过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPAR-γ）基因的siRNA腺病毒载体。方法遵循siRNA片段的设计原则，依据GenBank中PPAR吖基因（AF013266）的序列，设计3个特异性靶序列（36～54位、73～91位和404～422位）；体外合成对应发卡样DNA片段，经退火后，将其克隆入***载体，通过PCR和I-CeuI和PI-SceI酶切鉴定后，再亚克隆入pAdeno-X腺病毒载体。对插入序列进行DNA序列分析。结果发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后，电泳可见明亮靶条带；PCR扩增和酶切鉴定得到阳性克隆pSIREN-Shuttle—siPPAR-γ1、pSIREN-Shuttle—siPPARγ-2和pSIREN-Shuttle—siPPARγ-3。亚克隆重组腺病毒载体pAdeno—***^t-1、pAdeno—X-siPPARγ-2和pAdenc-X—siPPARγ-3，经测序鉴定证实插入DNA序列与设计完全一致。结论成功构建3个靶向PPARγ基因的siRNA重组腺病毒载体，为进一步的基因治疗研究奠定了实验基础。

摘要：目的构建与鉴定联合调控降钙素基因相关肽（CGRP）和过氧化物酶体增殖子活化受体-γ（PPARγ）基因的重组载体。方法将CGRP基因完整ORF克隆，设计其两端带MluI酶切位点，与TGFP融合蛋白表达单元间用一段柔性链连接，CGRP基因ORFcDNA纯化后与线性化pGFP-V-RS载体连接；按照siRNA的设计原则，设计靶向PPARγ的siRNA寡核苷酸靶序列，将发卡样siRNA寡核苷酸靶序列退火后克隆入线性化pGFP-V-RS载体；再在此载体中克隆入CGRPORFcDNA片段。进而将此3个质粒做酶切及测序鉴定。结果表达CGRP基因的pG-FP-V-RS-exCGRP、沉默PPARγ基因表达的pGFP-V—RS-siPPARγ和表达cGfuP且同时沉默PPARγ的pGFP—V-RS-siPPARγ-exCGRP，经酶切及测序鉴定的结果与设计均完全一致。结论成功构建出联合调控CGRP表达和沉默PPARY的双基因重组载体。

摘要：目的 构建与鉴定沉默过氧化物酶体增殖子活化受体γ（PPARγ）同时表达降钙素基因相关肽（CGRP）基因重组载体.方法 选用pGFP-V-RS载体,将PPARγ小干扰RNA（siRNA）寡核苷酸靶序列连接入pGFP-V-RS载体,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ;将CGRP片段与Mlu Ⅰ酶切,并与末端羟基化的线性质粒pGFP-V-RS重组连接,得到重组载体pGFP-V-RS-exCGRP.将获取的CGRP基因片段连接入线性化重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ,酶切鉴定及测序正确后得到重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP.收集第3代HEK-293细胞,将细胞分为4组：CON组：转染空载体pGFP-V-RS质粒,作为对照；SI组：转染重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ质粒；EX组：转染重组pGFP-V-RS-exCGRP质粒；DOU组：转染重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP质粒.每组电极杯中加入5x106个细胞,并分别加入上述质粒2.5μl,给予直流电低压脉冲1次,时间15 ms.培养48 h后收集各组细胞,用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）与Western blot检测细胞内PPAR、CGRP mRNA及蛋白的表达.结果 重组双基因载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP经酶切鉴定及测序结果与设计完全一致.电转染HEK-293细胞后,DOU组细胞PPARγ基因呈低表达,PPARγmRNA与其蛋白的相对表达量为0.036±0.003、0.108 ±0.031,与EX组（0.156±0.014、0.778±0.103）及CON组（0.148±0.014、0.742 ±0.143）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,与SI组（0.054±0.005、0.135 ±0.039）比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.DOU组细胞CGRP基因呈高表达,CGRP mRNA与其蛋白的相对表达量为1.144±0.106、1.244±0.184,与SI组（0.320±0.030、0.370±0.089）及CON组（0.444 ±0.041、0.274±0.062）比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,与EX组（1.021 ±0.095、1.221±0.181）比较,差异无统计学意义（P＞0.05）.结论 成功构建出沉默PPARγ基因并表达CGRP基因的重组载体pGFP-V-RS-siPPARγ-exCGRP,能够有效阻断PPARγ基因表达,同时促进CGRP基因表达.

摘要：目的:构建针对过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(PPARγ)基因的siRNA腺病毒载体。方法:依据siR-NA设计原则,在PPARγmRNA(AF013266)序列中设计2个特异性靶序列(36-54、73-91),体外合成对应发卡样DNAs,退火后先将其克隆入pSIREN-Shuttle载体,再亚克隆入pAdeno腺病毒载体,对插入序列进行DNA序列分析。结果:发卡样siRNA单链DNA寡核苷酸退火后,电泳可见明亮靶条带。连接退火寡核苷酸和pSIREN-Shuttle载体得到阳性克隆pSIREN-Shuttle-siPPARγ-36、pSIREN-Shuttle-siPPARγ-73。同源重组后得到亚克隆pAdeno-siPPARγ-36、pAdeno-siPPARγ-73,测序证实插入序列与设计序列完全一致。结论:成功构建2个靶向PPARγ基因的siRNA载体pAdeno-siPPARγ-36和pAdeno-siPPARγ-73。