摘要：目的体外实验研究PLCε基因调节人膀胱癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法设计并合成针对PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列,构建重组腺病毒Ad-sh PLCε。T24细胞感染Ad-sh PLCε腺病毒后,用Western blot检测PKCα/β及TBX3、E-cadherin的表达;用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测膀胱癌细胞T24的迁移、侵袭能力。结果 Ad-sh PLCε重组腺病毒感染膀胱癌细胞T24,对其PLCεmRNA表达抑制率为75.6%,对其PLCε蛋白表达抑制率为67.4%。Ad-sh PLCε感染组T24细胞迁移能力较空载组和空白对照组明显减弱(P<0.05);重组腺病毒Ad-sh PLCε感染组T24细胞穿膜细胞数较空载组和空白对照组明显减少(P<0.05)。Ad-sh PLCε重组腺病毒感染膀胱癌T24细胞后下游PKCα/β的活化受到抑制(P<0.05),同时,TBX3的表达减少,而E-cadherin的表达增高(P<0.05)。结论通过以重组腺病毒干扰抑制PLCε基因,能有效抑制膀胱癌T24细胞系中PLCε下游PKCα/β的活化情况及TBX3,E-cadherin的表达变化,并且对T24细胞的迁移、侵袭能力具有一定的抑制作用。

摘要：目的:建立实时荧光定量PCR检测长链非编码RNAHULC的方法,探讨其在作为肝癌标志的应用价值。方法:根据Genebank中的HULC lncRNA(AY914050.1)全序列,设计HULC基因的特异引物,构建HULC基因的T克隆载体,命名为pMD18-T-HULC;以pMD18-T-HULC为实时荧光定量PCR检测HULC的标准品,建立实时荧光定量PCR检测HULC的方法并进行方法学评价。应用此方法检测8种肿瘤细胞株、肝癌组织、其它癌及癌旁组织中HULC lncRNA的表达。结果:HULC实时荧光定量PCR检测方法学的最低检测限为1.8×103拷贝/L,线性范围为1.8×103拷贝/L至4.6×109拷贝/L;该法的批内变异系数(CV)<2.0%,批间CV<8.0%。其在肝癌组织和肝癌细胞株起始表达量为(7.6±3.1)×105拷贝/L至(5.6±3.2)×106拷贝/L,明显高于其它癌和癌旁组织HULC lncRNA表达量(<1.8×103拷贝/L)。新发现膀胱癌细胞株T24中表达量高〔(6.7±2.4)×105拷贝/L〕,但在膀胱癌组织中表达低(<1.8×103拷贝/L)。结论:成功建立了实时荧光定量PCR检测HULC lncRNA的方法,HULC lncRNA可望作为肝癌的标志。

摘要：目的:研究shRNA对肝癌细胞株HepG2中COX-2基因表达的抑制作用,同时检测对细胞周期和细胞生长的影响。方法:设计、合成一对环氧化酶-2(COX-2)基因编码的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,定向克隆至质粒载体pGenesil-1,构建抑制COX-2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA shRNA)的重组表达质粒pshRNA-COX-2,用脂质体LipofectamineTM2000转染肝癌细胞HepG2,经RT-PCR和Westernblot分别检测pshRNA-COX-2重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白抑制效应,流式细胞仪检测细胞周期、细胞计数检测细胞生长变化。结果:pshRNA-COX-2重组表达质粒能够抑制COX-2基因表达。与未转染肝癌细胞HepG2相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒转染肝癌细胞后,COX-2mRNA和蛋白表达明显降低,抑制率分别为69.9%和50.3%;G0-G1期细胞由55.4%上升为77.9%,S期细胞由31.1%下降为16.2%;细胞生长明显减慢。结论:构建的pshRNA-COX-2重组表达载体能够显著抑制COX-2基因表达;引起G0-G1期细胞增多,S期细胞减少,从而阻止肝癌细胞生长。

摘要：天蚕素A(Cecropin A,CA)是来源于惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)的含有37个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广等特点。为降低天蚕素A对宿主的毒性及提高其表达丰度和稳定性,在序列分析的基础上设计了3条天蚕素A氨基酸序列,分别为CA19、CA36和CA210。根据大肠杆菌密码子的偏爱性分别合成相应的3对寡核苷酸链,并通过重叠PCR方法合成成熟肽CA。将含有CA19、CA36、CA210和CA1～5个拷贝基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和BLR(DE3)PlysS,成功构建了串连融合表达载体,为下一步的抗菌活性及免疫表位的分析打下基础。

摘要：目的构建MRP2基因的真核表达载体pGenSil-1-MRP2-siRNA,并观察其转染人结肠癌耐长春新碱细胞株HCT-8/V前后MRP2基因和ABCC2蛋白表达变化以及对化疗药物敏感性变化。方法设计MRP2特异性siRNA的序列,克隆至pGenSil-1质粒中,测序鉴定后,用脂质体将重组质粒转染至HCT-8/V细胞中,用定量RT-PCR和Western blot检测MRP2的表达,MTT实验测定pGenSil-1-MRP2-siRNA和长春新碱对HCT-8/V细胞增殖抑制作用。结果在结肠癌耐药细胞HCT-8/V中,RNAi明显抑制了MRP2 mRNA及蛋白的表达,在相同浓度化疗药物的作用下,RNA干扰组细胞凋亡比例显著高于对照组(P<0.01),表明细胞耐药性显著下降,对药物敏感性显著增高。结论成功构建了MRP2的siR-NA真核表达载体,并且对结肠癌耐药细胞MRP2的表达有明显抑制作用,取得良好的逆转耐药效果。

摘要：目的构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用。方法采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1mRNA水平。设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组。采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平。结果白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA。针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1mR-NA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达。结论白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调。

摘要：目的利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病（CML）bcr／abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法，为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病（MRD）的监测提供有效手段。方法用逆转录PCR方法（RT—PCR）扩增K562细胞的bcr／abl融合基因，A-T克隆法构建定量标准模板；设计自身淬灭荧光引物（探针），建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法（FQ—RT—PCR），并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测；然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr／abl mRNA。结果建立的FQ—RT—PCR方法可检测10copies／μl的bcr／abl重组质粒，并能从10^5个正常细胞中检出1个白血病细胞，该方法的批内、批间变异系数（CV）分别为2．1％、6．1％，线性检测范围为10^2-10^9copies／μl。25例CML患者bcr／abl融合基因mRNA表达量中位数为4．50×10^4[（0．45—89．00）×10^4]copies／μg RNA，其中11例慢性期初诊患者bcr／abl mRNA表达量中位数为5．45×10^4[（2．95—19．30）×10^4]copies／μg RNA，6例急变期患者bcr／abl mRNA表达量中位数为13．00×10^4[（4．10～89．00）×10^4]copies／μg RNA，8例慢性期治疗后复查患者bcr／abl mRNA表达量中位数为2．35×10^4[（0．45—5．12）×10^4]copies／μg RNA，CML急变期患者bcr／abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义（q=3．41，P〈0．05）。PCR产物经电泳分析，其中21例CML患者为b3a2型，4例CML患者为b2a2型；3例急性淋巴细胞白血病（ALL）患者中，1例有bcr／abl mRNA表达，为b2a2型。结论所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好，结果用拷贝数表示，准确可靠，利于标准统一。可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测。

摘要：在阐述首席研究员负责制(principal investigator responsibility system,PIRS)下引入科研型实验室综合信息系统(Laboratory Information Systems,LIS)的必要性和可行性的基础上,提出基于C/S、B/S结合模式的LIS总体结构,给出了系统的功能模块、设计特色和关键问题解决方法等。其LIS运行结果表明该LIS能为PIRS对人力、物流、财务及质量控制的管理提供强大支持。

摘要：为构建肺炎链球菌减毒活疫苗SPY1矿化菌,并进一步探究其自身稳定性、热稳定性等生物学特性的改变,本研究以肺炎链球菌D39基因组DNA为模板设计合成构建突变体lyt A基因所需引物,采用插入失活的方法构建SPY1-△lyt A突变株,并以缺陷菌的生长特性以及PCR的方法进行鉴定;将SPY1-△lyt A突变株于富钙环境中培养,用不同浓度的磷酸盐进行滴定,使其形成磷酸钙矿化壳,通过扫描电镜以及直接荧光反应来检测疫苗菌株矿化情况;并将矿化菌株与未矿化菌株同时置于37℃不同时间后通过比较其存活率来评价矿化菌的热稳定性。PCR结果以及细菌长时间不溶解的生长特性表明成功构建了SPY1-△lyt A突变株;扫描电镜以及直接荧光反应结果显示细菌表面形成Ca Pi矿化外壳,并且SPY1-△lyt A-Ca Pi矿化菌具有较好的热稳定性。本研究为肺炎链球菌活菌疫苗的进一步研发奠定了基础。

摘要：设计合成融合表达标签谷胱甘肽S-转移酶(GST)的二价亲和标记试剂,用于功能化磁珠后位点选择性固定化标签GST,为磁分离筛选配体混合物库提供固定化融合靶蛋白的候选方案。为减少疏水配体在标签GST活性位点的结合,需同时占据标签GST双活性中心内疏水结合位点并发生共价修饰的二价亲和标记试剂。以双苯环为疏水定位基、溴乙酰基为巯基修饰基团、羧基为连接官能团得单价标记试剂,以二乙基三胺为连接臂将单价标记试剂与连接臂两端伯胺连接得标签GST的对称二价亲和标记试剂,再以线性三胺连接臂中间的氨基与羧基磁珠偶联得功能化磁珠。表征目标化合物对标签GST的标记动力学、结合比;功能化磁珠对标签GST的不可逆固定化动力学和固载容量,及将磁珠表面二价亲和标记试剂转变成还原型谷胱甘肽(GSH)加合物后对标签GST可逆固定化的效果;以碱性磷酸酶及疏水荧光配体为模型考察磁珠固定化标签GST后的非特异结合。目标化合物对标签GST半抑制浓度为(22±0. 2)μmol/L,其与GSH的饱和加合物半抑制浓度为(0. 41±0. 06)μmol/L,二者与标签GST二聚体结合比接近1∶1。功能化磁珠对标签GST不可逆及可逆固定化的容量均接近25 mg/g磁珠。偶联GST的磁珠对蛋白非特异吸附很弱,再进一步用单价亲和标记试剂和GSH加合物封闭固定化标签GST剩余的活性位点后对疏水小分子也无显著结合。结果表明,所设计二价亲和标记试剂功能化磁珠适合用于标签GST及其融合表达蛋白的位点选择性固定化。