摘要：目的在感染甲型流感病毒（influenza Avirus，IFAV）的人气道上皮细胞（9HTEO）中观察与IFAV PB1、M2、NS、PB2、HA基因互补的反义硫代修饰寡核苷酸（ASODN）的抗病毒活性。方法细胞外体系观察设计的ASODN效率，筛选对IFAV有效的3个ASODN进行9HTEO的抗病毒效应。倒置显微镜下观察IFAV的致细胞病变作用和ASODN的细胞保护作用。MTT方法测细胞存活率，空斑试验、***、Westernblot、免疫荧光检测ASODN特异性抗病毒效应，MTF法检测ASODN对细胞的保护作用。结果IFAV感染复数（MO!）在0．1以上时，培养5d后IFAV感染的9HTEO细胞全部死亡。设计的ASODN能够提高感染细胞的存活率，且呈量效依赖关系。空斑试验、***、Westernblot、免疫荧光试验证实在细胞水平、基因转录水平、蛋白水平针对IFAV PB1、M2、NS基因mRNA转录起始点保守序列设计的ASODN具有特异性抗IFAV作用。结论ASODN具有较明显的抗病毒活性，为进一步研究和开发新型抗IFAV药物提供了实验依据。为高致病性禽流感（H5N1）的基因治疗提供了新的思路和理论依据。

摘要：目的探讨长疗程治疗剂量外源性糖皮质激素对生后早期发育脑损伤的可能性。方法设立与人类新生儿、1岁及成年脑发育进程相匹配的生后7d（postnatal 7days，PD7）、PD15及PD60不同13龄健康SD大鼠3组，共192只。模拟临床治疗婴儿痉挛泼尼松、促肾上腺皮质激素（ACTH）的剂量和疗程，确定实验用药剂量[泼尼松6mg／（kg·d），ACTH150U／（m^2·d）]，疗程4d。各日龄组被分为泼尼松或ACTH组及正常对照组，以及给药后停药3周组与相应对照组，每组均8只。分别在停药当天及停药3周后称取体重、脑重、尼氏染色及透射电镜观察脑组织病理改变，免疫组织化学检测Bcl-2、Bax蛋白表达，原位末端标记法（TUNEL）检测凋亡细胞，荧光分光光度计检测Caspase-3活性，流式细胞仪测定神经细胞线粒体膜电位。本研究统计方法采用两组间成组设计资料的t检验。结果（1）ACTH和泼尼松均引起PD7组、PD15组大鼠脑重显著减轻[PD7泼尼松组：（0．78±0．08）g，PD7泼尼松对照组：（0．89±0．08）g]，额叶皮层神经细胞数减少[PD7泼尼松组：（77．7±4．7）个／视野，PD7泼尼松对照组：（102．3±5．9）个／视野]，神经细胞超微结构明显异常。停药后3周，PD7组脑重及额叶皮层神经细胞数仍低于对照组。（2）用药后额叶皮层TUNEL阳性细胞数明显增多[PD7泼尼松组：（114．8±8．1）个／视野，PD7泼尼松对照组：（56．3±5．6）个／视野]、Caspase-3活性增高（PD7泼尼松组：345．3±13．0，PD7泼尼松对照组：166．3±6．4）、Bax蛋白表达增强（PD7泼尼松组：0．27±0．02，PD7泼尼松对照组：0．15±0．06）以及神经细胞线粒体膜电位降低（PD7泼尼松组：112．9±8．6，PD7泼尼松对照组：140．5±5．6），均以PD7组改变最突出。结论（1）长疗程ACTH和泼尼松对生后未成熟脑存在损伤可能性，年龄越小，损伤可能性越大，程度愈严重，且越不易完全恢复；（2）ACTH、泼尼松可能通过上调Bax蛋白，引起胞内Bax／Bcl-2比值增高和线粒体膜电位降低，进而激活Caspase酶系、神经细胞不可逆性过度凋亡，最终导致未成熟脑损伤。

摘要：目的:制备携带PreS1基因的重组腺病毒基因治疗载体,研究其对肝细胞的嗜向性。方法:设计合成含PreS1的腺病毒纤毛Fiber基因片段,置换野生型骨架质粒Fiber片段,同源重组法构建重组体rAd-PreS1,酶切鉴定后HEK293包装生成腺病毒,抽提蛋白Western blot检测目的蛋白PreS1表达。重组腺病毒rAd-preS1分别转染人正常肝细胞L02、人肺癌细胞A549、人喉癌细胞Hep2、人卵巢癌细胞SKOV3,同时野生腺病毒rAd作为阴性对照,荧光显微镜下观察各细胞内绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)表达程度,用细胞的病毒滴度值表示,检测其对肝细胞的嗜向性。结果:经酶切鉴定成功构建rAd-preS1载体,Western blot示蛋白分子量大小均约为63 kD目的条带。rAd-preS1感染L02细胞组GFP表达程度明显强于A549、Hep2及SKOV3细胞组(P均是0.000),而A549、Hep2及SKOV3各细胞组间GFP表达差异无统计学意义(P>0.05);对照组各细胞组间GFP表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论:含PreS1的重组腺病毒rAd-preS1显示出对人肝细胞具有较强嗜向性,而对非肝细胞无明显效果,这为进一步研究肝脏疾病靶向基因治疗奠定了基础。

摘要：目的构建组蛋白乙酰化酶转录辅激活酶Gcn5基因表达的干扰shRNA质粒并初步检测其性质,为研究干细胞诱导分化过程中乙酰化修饰所起的调控作用奠定基础。方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段,用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的pGenesil-1作为载体,构建相应7个shRNA质粒。脂质体共转染5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导的大鼠间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs),利用乙酰化酶特异性抗体Gcn5(H75)对转染细胞进行免疫化学检测,荧光显微镜图象分析系统,记数细胞,在同视野中记数转染阳性细胞以及干扰的阳性细胞,初步计算出其转染率和干扰效率。结果通过限制性内切酶酶切和DNA序列分析,重组质粒shRNA与设计相吻合;免疫细胞化学检测,发现转染阴性对照HK的细胞显现“饱满核”,乙酰化作用蛋白表达明显;转染shRNA质粒的细胞呈现十分明显表达减弱的“淡染核”或不表达的“空洞核”,转染率和干扰效率分别为93.7%和46.6%。结论构建的shRNA质粒能够达到干扰乙酰化作用的目的,为深入研究乙酰化作用奠定了一定的试验基础。

摘要：目的构建并筛选小鼠p300特异性siRNA载体,并观察p300表达降低对心脏特异性转录因子的调控作用,为进一步研究p300介导的组蛋白乙酰化失衡对心脏发育的影响奠定基础。方法针对小鼠p300基因的保守序列区域设计并构建3个重组质粒p300RNAi1,p300RNAi2和p300RNAi3。利用阳离子脂质体将其分别转染入体外培养的乳鼠心肌细胞,分别利用RT-PCR和免疫荧光从mRNA和蛋白水平检测p300表达,判断抑制效率,并检测心脏特异性转录因子GATA4的表达水平。结果 pSOS-HUS组和p300RNAi2组中p300mRNA水平表达较正常对照组无明显降低,而p300RNAi1组和p300RNAi3组中p300mRNA表达量较正常组有明显降低(分别为0.2208±0.0200,0.1708±0.0400,vs0.5095±0.0300),且差别有统计学意义(P<0.05),抑制率分别为56.7%和66.5%。转染p300RNAi1组和转染p300RNAi3组的GATA4mRNA表达水平(分别为0.4231±0.1100,0.2627±0.0800)明显低于正常组(0.8564±0.0700)和阴性对照组(0.8415±0.0400),差别有统计学意义(P<0.05)。结论 p300特异性siRNA质粒载体构建成功,p300RNAi1和p300RNAi3具有确切阻断p300蛋白表达的作用,并下调GATA4的表达。

摘要：目的:建立高度灵敏特异的质粒缺口-连接酶链反应-酶联免疫吸附法(Gap-LCR-ELISA)检测沙眼衣原体(Chlamy-diatrachomatisCT)。方法:根据CT共有隐蔽性质粒设计并标记4条寡核苷酸探针,对6型CT标准株和鹦鹉热衣原体及其他常见泌尿生殖道病原菌行Gap-LCR-ELISA。结果:质粒Gap-LCR-ELISA可检测出6型CT,并与其他病原体无交叉反应,其最低检测限为2.5个原体(elementarybodiesEB)比PCR敏感10倍。结论:质粒Gap-LCR-ELISA对检测CT感染具有极高的灵敏度和特异度,适宜于我国进行大规模CT流行病学调查。

摘要：目的构建小鼠白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)及其shRNA重组表达质粒。方法以小鼠脾脏细胞总RNA为模板,PCR扩增IL-17基因,并亚克隆至质粒pLVX-IRES-ZsGreen1,构建重组表达质粒pLVX-IL-17-IRESZsGreen1;设计并合成3对针对IL-17基因的shRNA序列和1对阴性对照shRNA序列,分别插入质粒pLVX-shRNA,构建重组干扰质粒pLVX-shRNA1、pLVX-shRNA2、pLVX-shRNA3和阴性对照质粒shRNAC,进行测序;用脂质体法将各重组干扰质粒分别与表达质粒共转染293T细胞,分为空白对照组、过表达组、shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组和shRNAC组,经荧光定量PCR和ELISA法分别检测各组细胞中IL-17基因mRNA的转录水平和蛋白的表达水平。结果 PCR扩增获得500 bp的目的基因,IL-17重组表达质粒及其shRNA重组质粒经酶切及测序鉴定证明构建正确;重组表达质粒转染293T细胞48 h后可见绿色荧光表达;过表达组IL-17基因mRNA及蛋白表达水平均明显高于空白对照组(P均<0.05),shRNA1组、shRNA2组和shRNA3组IL-17基因mRNA和蛋白表达水平均明显低于shRNAC组(P均<0.05)。结论成功构建了小鼠IL-17基因重组表达质粒及其特异性shRNA表达质粒,并筛选出shRNA1,其对IL-17的表达具有最佳的抑制效应。

摘要：目的:构建并鉴定靶向大鼠gnas基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)真核表达载体。方法:根据大鼠gnas基因mRNA序列设计并合成3条shRNA特异性寡核苷酸片段,退火形成双链后克隆进入线性化pGenesil-1.1载体,并进行酶切鉴定和测序,同时构建针对大鼠GAPDH基因的阳性对照质粒和不具有基因同源性的非特异性基因的质粒做阴性对照。结果:经酶切和测序鉴定分析,构建的shRNA已成功插入载体,并且与设计序列完全相符。结论:成功构建了靶向大鼠gnas基因的shRNA真核表达载体,为后续研究Gsα蛋白在心力衰竭中作用的体内外实验奠定了基础。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默热休克蛋白90β(heat shock protein90beta,Hsp90β)基因表达对Jurkat细胞生长的抑制作用。方法根据Hsp90β基因全长cDNA序列Hsp90B1(NM_003299.1),设计并构建针对Hsp90β基因的siRNA真核表达载体,应用LipofectamineTMLTX转染入Jurkat细胞后,Real-time PCR检测Hsp90βmRNA水平的变化,筛选出沉默效果最好的Hsp90βsiRNA干扰片段;Western印迹法检测Hsp90β蛋白表达水平;MTT法和流式细胞仪检测干扰前后对Jurkat细胞生长抑制作用。结果成功构建Hsp90β基因特异性的真核表达载体pSOS-Hsp90βi,转染Jurkat细胞后发现pSOS-Hsp90βi2的沉默效果最明显,Jurkat细胞Hsp90βmRNA及蛋白表达均明显降低(P<0.05)。Hsp90β基因表达沉默后,Jurkat细胞增殖明显受抑(P<0.01),实验组与对照组的细胞凋亡率分别为:(2.69±0.34)%、(3.63±0.38)%、(19.56±0.62)%,细胞凋亡率比空白对照组及转染pSOS-Hsp90βi control组明显增加,差异具有显著意义(P<0.05)。结论靶向Hsp90β的siRNA下调Hsp90β表达对人白血病Jurkat细胞有明显的生长抑制作用。

摘要：目的通过组蛋白乙酰化作用相关shRNA质粒转染5氮杂胞苷(5-azacytid ine,5-aza)诱导后不同时间段间充质干细胞心肌发育基因的检测,探讨乙酰化修饰在干细胞特化心肌样细胞转录调控中的作用。方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段,用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence prote in,GFP)基因的pGenesil-1作为载体,构建相应7个shRNA质粒。5-aza诱导大鼠间充质干细胞(m esenchym al stem cells,MSCs)24 h、2、4、7 d,分别用重组shRNA质粒脂质体共转染后提取RNA,逆转录PCR检测Gcn5基因和心肌早期发育基因GATA4的表达。结果经特异性限制性内切酶酶切分析和DNA序列测定,质粒构建与设计符合;各个时间段对照组Gcn5和GATA4均有表达,而实验组却无相应表达。结论通过实验提示封阻干细胞染色质组蛋白乙酰化可以达到抑制干细胞特化心肌细胞转录过程的作用,这为进一步研究组蛋白末端乙酰化修饰与干细胞分化调节机制奠定实验室基础。