摘要：背景:已证实骨形态蛋白9是骨形态蛋白家族最具潜力的促骨分化生长的因子之一,目前国内在成骨方面对骨形态蛋白9的报道非常少。目的:探讨腺病毒介导的人骨形态蛋白9基因转染兔脂肪干细胞的可行性,及其转染后的成骨作用。设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2007-08/2008-06在重庆医科大学附属儿童医院儿研所外科研究室完成。材料:新西兰大白兔5只,由重庆医科大学实验动物中心提供。携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒载体由重庆医科大学附属儿童医院罗庆研究员构建并惠赠。方法:取兔颈后部脂肪组织,体外分离纯化脂肪干细胞。取生长良好的第3代细胞,以1×108L-1密度接种于6孔板,转染组经感染复数为100的载有人骨形态蛋白9基因的腺病毒转染脂肪干细胞,并设立未转染对照组。主要观察指标:细胞形态及生长曲线变化,荧光显微镜及RT-PCR检测转染后人骨形态蛋白9基因mRNA的表达,碱性磷酸酶及钙茜素红染色测定转染后成骨活性。结果:转染1周后细胞汇合呈铺路石状,2周后形成钙化结节;未转染对照组细胞形态较前无明显变化,无明显的钙化结节形成。与未转染对照组比较,转染组细胞停滞期延长,数量轻度下降,倍增时间延长。脂肪干细胞转染骨形态蛋白9基因后12h后即有荧光表达,转染3,6,9,12d后人骨形态蛋白9mRNA均呈阳性表达且逐渐增强,未转染对照组呈阴性。转染组碱性磷酸酶活性随转染时间的延长呈升高趋势,钙茜素红染色可见钙化结节;未转染对照组碱性磷酸酶染色及钙茜素红染色均呈弱阳性表达。结论:携带人全长骨形态蛋白9基因的腺病毒可成功转染兔脂肪干细胞,转染后脂肪干细胞高表达骨形态蛋白9,且具有明显的成骨作用。

摘要：利用一种快速简便经济直接的筛选特异RNA干扰序列的方法,筛选结缔组织生长因子(CTGF)基因特异RNA干扰序列.设计合成分别含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,以pTM1-CTGF为模板PCR获得CTGF基因,定向克隆入pSOS-HUS质粒得到质粒pSOS-HUS-CTGF.质粒pSOS-HUS-CTGF经过SfiⅠ酶切后分别与5条CTGF干扰序列和1条随机对照序列克隆获得pSOS-CTGFi1,pSOS-CTGFi2,pSOS-CTGFi3,pSOS-CTGFi4,pSOS-CTGFi5,pSOS-CTGFicontrol.质粒转入HEK293细胞中,于第1、3、5、7d倒置荧光显微镜照相,IPP图像分析软件测定光强度值.5种CTGF特异RNA干扰载体的相对光强度分别为0.24%、41.47%、2.93%、20.40%和28.85%.特异性序列site1和site3的沉默效果最好.pSOS-HUS系统采用双向启动子,通过绿色荧光蛋白下调水平来衡量干扰序列的沉默效果具有可靠直观重复性好的优点.利用该方法成功筛选了高沉默效果的CTGF特异RNA干扰序列.

摘要：目的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)缺乏症是最常见的遗传性溶血性红细胞酶缺陷病,绝大多数为编码区单碱基突变,现有的多种基因突变检测方法均存在漏检率。该研究拟探讨RT-PCR测序法检测G6PD缺乏症基因突变的可行性。方法将2013年8月至2014年7月的195例贫血查因或体检儿童根据G6PD/6GPD比值(<1.00)分为G6PD缺乏组(130例)和对照组(G6PD/6GPD比值≥1.00)65例,优化引物设计及PCR扩增条件,采用RT-PCR测序法对G6PD缺乏组及对照组进行全编码序列分析,基因组DNA测序验证。结果 G6PD缺乏组的基因突变检出率为100%,共检出13种错义突变,包括1种新突变。对照组中28例男性均没有检出错义突变;37例女性中13例检出杂合型错义突变,1例国内外未见报道的纯合型同义突变C1191T,14例C1311T多态位点。对照组的女性标本存在较高的G6PD缺乏症(携带者)漏检率(35%,13/37)。结论 RT-PCR测序法对G6PD基因突变检出率高,具有较大临床诊断价值。

摘要：背景：近年来通过细胞移植修复扩张型心肌病受损心肌、提高心功能已成为研究热点，但细胞移植后对心脏电生理的影响仍有待观察。目的：观察同种异体体内移植骨髓间充质干细胞移植后对扩张型心肌病模型兔心功能、结构及电生理的影响。设计，时间及地点：随机对照动物实验。于2004-01／2006—05在重庆医科大学附属儿科研究所电生理实验室完成。材料：选用43只新西兰白兔，体质量3．0～3．5kg，雌雄不拘。阿霉素为浙江海正医药公司产品，生产批号为050307。SSD-5000超声诊断仪为日本Aloka生产，RM6240多导电生理记录仪为成都仪器厂生产。方法：①摸球法将实验兔随机分为正常组（n=12），细胞移植组（n=13），模型组（n=13），后两组实验兔参考Amoda等的方法采用阿霉素诱导扩张型心肌病模型，每次1mg／kg，每周2次，连续8周，正常组不造模。获取剩余5只实验兔骨髓原液，用贴壁筛选法分离、扩增、纯化骨髓间充质干细胞。②细胞移植组及模型组模型建立成功后3周暴露心脏，将细胞分4点注射到左室前壁，模型组于相同条件下注射等体积DMEM／F12培养基。正常对照组在相同条件下不注射任何药品。主要观察指标：移植后4周，①采用超声诊断仪检测3组大鼠左室舒张末期内径、左室收缩末期内径、左室射血分数、左室短轴缩短率等心功能指标。②应用多导电生理记录仪检测大鼠心肌单相动作电位振幅、0相上升的最大速率、单相动作电位时程从激动开始至复极完成50％及90％的时间，记为MAPD50及MAPD90。③取细胞移植组移植区心肌及模型组心肌标本，行透射电镜及光镜下组织学观察，同时进行植入细胞肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的免疫荧光检测。结果：纳入实验兔43只，细胞移植组中各有9只因阿霉素急、慢性毒性作用以及手术后感染原因死亡，其余25只均进入结果分析。①心功能检测结果：细胞移植组实验兔左室收缩末期内径较模型组减小，左室射血分数、左室短轴缩短率均高于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。②心电生理检测结果：细胞移植组实验兔MAPD50、MAPD90短于模型组，差异有统计学意义（P〈0．05）。③心肌组织学观察：模型组可见心肌细胞呈广泛的水肿和显著的空泡变性改变，电镜示心肌细胞线粒体肿胀，增生，肌节长短不一，出现异常收缩带，可见局部心肌溶解，细胞移植组移植区组织与之相比，各种受损表现较轻，且移植细胞有肌钙蛋白T和缝隙连接蛋白43的表达。结论：同种异体体内移植骨髓间充质干细胞后在一定程度上可改善扩张型心肌病模型兔心功能，减轻病理损害，并可能抑制心电紊乱的进一步发展。

摘要：背景：Adeasy腺病毒系统是由***等改良的基于E1和E3区缺失的重组腺病毒系统。相比传统的在真核细胞中收集和测试重组后的病毒颗粒的方法，其采用了在细菌中通过质粒同源重组的方法获得病毒颗粒，从而简化了腺病毒的构建和测试流程，而且，它能够通过整合入病毒基因组的标记基因GFP实现对转染细胞的荧光追踪，从而在近年来被广泛用作基因转染的载体。目的：用Adeasy系统构建荧光蛋白基因标记的腺病毒载体Ad-hIGF-1，并检测其在靶细胞骨髓间充质干细胞中的表达。设计：重复测量实验。单位：重庆医科大学儿科研究所。方法：实验于2004-11~005-03在重庆医科大学儿科研究所完成。①重组腺病毒载体的构建：从pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短的目的基因hIGF-1，按Ad—easy腺病毒系统同源重组的标准步骤获得重组阳性质粒pAd-hIGF-1和重组空白质粒pAd-0，电穿孔转化感受态XL—1细菌，扩增后获得重组腺病毒质粒，去内毒素质粒大抽试剂盒大量抽提质粒备转化HEK293细胞；②腺病毒包装及扩增：PacI酶切线性化pAd-hIGF-1和pAd-0，纯化后转染HEK293细胞，观察GFP的表达，待细胞90％以上漂浮后，冻融法裂解细胞收集第一轮病毒上清即为Ad—hIGF—1（重组目的腺病毒）和Ad-0（重组空白腺病毒），将收集病毒上清重复多次感染293细胞（乒乓交互感染）以提高病毒滴度。③骨髓间充质干细胞的培养及转染!采用通用的标准密度梯度离心法分离纯化兔MSCs于37℃、5％CO2孵箱培养，隔天换液，10d细胞融合达70％～80％，贴壁紧密，细胞形态均一，呈典型的涡漩状排列，传代至第3代按病毒感染复数分组转染。主要观察指标：①腺病毒载体的构建及鉴定。②目的基因hIGF-1在HEK293的表达及病毒滴度。③目的基因在骨髓间充质干细胞中的表达。结果：①重组腺病毒的鉴定：从质粒pcDNA3．1-hIGF—1中顺利扩增出约400bp大小的清晰条带，与预期相符；pMD18-hIGF—1测序结果经Blast2．0比对与公布序列一致性99．9％（281位碱基同义突变，未影响氨基酸翻译：ggt／ggc—Gly）：pAdtrack—CMV空载体和pAdtrack-hIGF-1分别双酶切（KpnI和HindIH）鉴定正确。质粒pAdEasey—1和Ad—hiGF-1用PacI酶切鉴定鉴定正确。证实病毒质粒同源重组成功。②荧光表达及滴度测定：重组质粒pAd—hIGF-1经PacI线性化后转化HEK293E细胞，48h后在荧光显微镜下即可见GFP的表达，72h表达最强。约5～7d后细胞出现病毒感染的特征性CPE，由此计算出腺病毒滴度为3．0×10^9pfu／mL。③靶细胞的感染及表达效率：病毒转染骨髓间充质千细胞24h后观察到绿色荧光的表达，72h左右荧光达到最强。免疫细胞化学SP法DAB染色显示在感染的骨髓间充质干细胞胞浆中有棕黄色阳性颗粒出现。SDSPAGE电泳在7．8KD附近出现明显条带，与实际人胰岛索样生长因子-1分子量7．6kD相符，证实转染含目的基因的重组腺病毒后的骨髓间充质干细胞中有较高量的人胰岛素样生长因子-1的表达。结论：本实验用Adeasy系统和扩增的截短型外源性基因hIGF-1构建了具有较强感染能力的腺病毒载体pAd-hIGF—1，免疫细胞化学和WesternBlot等方法检测证实了目的基因在靶细胞骨髓间充质干细胞得到了理想表达。

摘要：目的 :已经肯定在孕妇外周血中有胎儿的遗传物质出现 ,本研究尝试直接利用孕妇血浆和血清进行胎儿性别鉴定 ,以明确其在无创性产前基因诊断中实际应用的可行性。方法 :在SRY基因高保守区设计两对性别特异性引物 ,利用巢式聚合酶链反应 (Nest PCR) ,对 5 0例孕妇血浆和血清中胎儿游离核酸进行扩增 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 (PAGE) ,DNA测序确定扩增产物的准确性。结果 :出生证实分娩男婴 2 8人 ,其阳性检出率 ,血浆组 32 2 % (9/ 2 8) ,血清组为 4 6 4 % (13/ 2 8)。而 2 2例分娩女婴的标本无论血清还是血浆组均未出现阳性结果。结论 :直接利用孕妇血浆和血清均可以鉴别胎儿的性别 。

摘要：目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor,hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞。方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成。根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达。结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达。结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择。

摘要：目的　建立检测沙眼衣原体感染的具有高度敏感性和特异性的缺口 连接酶链反应 酶联免疫吸附测定法。方法　根据CT主要外膜蛋白稳定区设计 2对互补探针并分别对其两端标记生物素和地高辛 ,对 6种CT标准株、鹦鹉热衣原体标准株和其他细菌进行Gap LCR反应并以ELISA和EB染色电泳检测扩增产物以比较两者的检测限度。 结果　Gap LCR可检出 6种CT标准株并不与其他细菌发生交叉反应 ,ELISA可检出 1 0fgDNA模板的扩增产物 ,较EB电泳法敏感 1 0倍。结论　Gap LCR ELISA是一高度敏感特异的检测CT感染的核酸扩增技术 。

摘要：目的:探讨从孕妇外周血细胞中检测胎儿基因组和血浆中捕获胎儿游离核酸方法的实用性。DNA方法:在基SRY因高保守区设计两对性别特异性引物,利用巢式聚合酶链反应分别对例孕妇外周血胎儿基因组和血浆中游(nest-PCR)50DNA离核酸进行特异性扩增,聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,测序验证扩增产物的准确性。(PAGE)DNA结果:名孕妇中名分娩男5028婴,名分娩女婴。基因片段阳性检出率:基因组为();游离核酸组为()。名分娩女婴者除例22SRY75%21/2832%9/28221基因组检测结果阳性外,其余均为阴性结果。本研究检测系统灵敏度为52.8pg/μ。l结论:孕妇外周血中胎儿基因组和游DNA核酸检测可作为产前基因诊断的途径,两者联合应用有助于提高胎儿遗传信息的检出率。

摘要：目的分析重庆地区儿童支气管哮喘急性加重住院的危险因素,为制定个体化防治方案,有效控制哮喘提供依据。方法随机选择2009年1月至2009年12月重庆医科大学附属儿童医院呼吸中心及江津区人民医院儿童哮喘急性发作住院患儿共193例,自行设计调查问卷,收集资料进行分析。随机选择门诊随访>3个月,接受正规维持治疗的无哮喘发作慢性持续期维持控制治疗的患儿为对照组,分析儿童哮喘急性发作的危险因素。结果呼吸道感染为哮喘急性发作住院的第一独立危险因素,占85.5%(165/193)。未规范使用控制性药物者达71.5%(138/193),包括既往未诊断哮喘102例和已诊断哮喘但未用药的36例,与维持控制治疗组未规范用药(21/110,19.1%)相比有统计学意义(P0.05)。结论呼吸道感染为重庆地区儿童哮喘急性发作的首要危险因素,其次为未及时诊断哮喘、未正规使用哮喘控制药物,各种过敏原诱发哮喘急性发作也需引起重视。