摘要：目的:构建肿瘤特异性启动子Survivin驱动的小发夹RNA(shRNA),通过下调HepG-2肝癌细胞中CD133的表达,探讨其对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响。方法:①构建pEntr-Surp-shRNA真核表达载体,转染HepG-2肝癌细胞,Hela细胞,293T细胞。②设计shRNA干扰片段,筛选干扰最佳干扰效率的CD133干扰片段,重组载体***-shRNA972,***2377,***-shRNA485并筛选出稳定表达shRNA的转染克隆。③***-shRNA972,***-shRNA2377,***485腺病毒分别转染HepG-2肝癌细胞株,建立***-shRNA972,***-shRNA2377,***-shRNA485实验组,未转染腺病毒组为空白组。感染肝癌细胞株,应用RT-PCR和Western blot检测CD133 mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell法检测细胞体外增殖和侵袭能力。结果:①成功构建了Survivin启动子调控的shRNA真核表达载体pEntr-Surp-shRNA,在293T细胞株无荧光,而在Hela、HepG-2细胞株中荧光表达明显,证实Survivin具有肿瘤特异性。②成功包装***972,***-shRNA2377,***-shRNA485腺病毒。③RT-PCR和Western blot检别显示***-shRNA972、***2377,有封闭CD133 mRNA和蛋白表达的效果;计算实验组与空白组相比mRNA抑制率分别为(63.44±0.02)%、(56.98±0.03)%;***-shRNA972、***-shRNA2377、***-shRNA485组蛋白抑制率分别为(55.43±0.40)%、(48.65±0.20)%、(34.67±0.40)%;实验组细胞的增殖和侵袭能力也受到明显抑制,***-shRNA972组生长抑制率为(72.88±0.74)%,***-shRNA2377组生长抑制率为(59.90±0.87)%,***-shRNA485组生长抑制率为(30.18±0.95)%。结论:肿瘤特异性启动子Survivin调控腺病毒介导的shRNA能显著下调CD133基因的表达,抑制肝癌细胞株HepG-2的增值和减弱其侵袭力。

摘要：目的利用酵母双杂交技术筛选线粒体促凋亡因子野生型Smac/DIABLO的相互作用蛋白。方法①设计促凋亡因子野生型Smac/DIABLO引物,利用PCR在成人肝cDNA文库中扩增野生型Smac/DIABLO基因片段,构建酵母真核表达载体pDBLeu-Smac/DIABLO。②pDBLeu-Smac/DIABLO诱饵质粒转化酵母MaV203,Western blot检测融合蛋白在酵母中的正确表达,自激活作用的检测并确定抑制His基础表达的3AT浓度。③对成人肝cDNA文库的筛选。选择能同时激活His、Ura、LacZ3个报告基因的克隆为阳性,利用回转实验和GST-pull down对阳性克隆进行鉴定。结果成功构建pDBLeu-Smac/DIABLO载体,转化酵母细胞MaV203,无细胞毒性,无自激活作用,3AT浓度为25mmol/L。经回转实验和GST-pull down证实了线粒体促凋亡因子Smac/DIABLO与核受体NR4A1之间具有相互作用。结论Smac/DIABLO可能通过与核受体NR4A1的相互作用来影响核受体NR4A1对细胞生存或者凋亡的调控。

摘要：目的:构建针对表皮生长因子受体(Epidermal growth factor recepter,EGFR)家族的小分子发夹状RN(A Small hairpinRNA,shRNA)干扰质粒表达载体,为本课题下一步研究提供有力工具。方法:选择放疗不敏感的卵巢癌细胞SKOV3中高表达的EGFR家族同源性基因为靶基因,根据shRNA的设计原则,设计实验组及对照组shRNA。体外合成2段编码短发夹RNA序列的DNA单链,退火,克隆到相应载体pGensil-1的polⅢ启动子下游。结果:经酶切和DNA测序鉴定成功构建了EGFR家族同源性基因的RNA干扰表达载体,分别命名为pGensil-1-E及pGensil-1-C。为下一步体外、体内实验奠定了基础。