摘要：目的:构建丙型肝炎病毒(Hepatitis Cvirus,HCV)F蛋白的原核表达载体,表达pET32a(+)-HCVF融合蛋白。方法:根据丙型肝炎病毒F基因的全序列设计引物,以HCV1a型cDNA质粒H/FL为模板,通过PCR方法扩增得到F基因的编码区序列,将其定向克隆于含有6×Histag的原核表达载体pET32a(+),转化大肠杆菌JM109,经菌落PCR筛选,双酶切和测序鉴定阳性克隆后,转化大肠杆菌BL21,采用IPTG诱导表达融合蛋白,表达产物经SDS-PAGE电泳分析和Western-blot检测鉴定,并用Ni-NTA亲和层析柱纯化。结果:F基因以正确的方式插入到pET32a(+)载体中,重组质粒转化大肠杆菌BL21后经IPTG诱导表达,出现了与预期分子量相符的蛋白条带,该蛋白通过Westernblot检测具有6×Histag蛋白的免疫学活性。结论:成功构建了丙型肝炎病毒F蛋白的原核表达载体pET32a(+)-HCVF并表达和纯化出重组融合蛋白,为进一步研究F蛋白的生物学功能奠定了基础。

摘要：本文将Dicer基因的RNA酶III结构域作为靶区,设计并构建了两个抗Dicer基因的小发夹样RNA(shRNA)表达载体,将其转染2215、结肠癌TC细胞和基因组中整合有绿色荧光蛋白基因(GFP)的HepG2A9细胞,通过RT-PCR评价RNA干扰抑制Dicer基因表达的效率;当HepG2A9细胞Dicer基因表达被上述RNA干扰抑制时,再转染抗GFP的shRNA表达载体,通过RT-PCR和荧光显微镜观察GFP表达水平。结果显示,在不同细胞系中,这两个抗Dicer基因shRNA表达载体,均能明显抑制Dicer基因的表达;当Dicer基因受抑时,后续转染抗GFP的shRNA表达载体不能有效抑制GFP的表达。结果表明,抗Dicer基因shRNA表达载体,能够明显抑制Dicer基因的表达;shRNA表达载体的功能发挥需要Dicer酶的直接参与。

摘要：目的筛选并合成CIT基因的最佳siRNA干扰序列,并检测其对人肝癌细胞株SK-Hep-1中CIT基因表达的干扰效率及其对SK-Hep-1人肝癌细胞增殖的影响。方法根据CIT基因序列设计并合成3个siRNA靶点,通过脂质体转染法转染入SK-Hep-1人肝癌细胞,用Real-timePCR和蛋白质印迹法检测其对目的基因CIT的敲减效率。采用细胞免疫化学、共聚焦显微镜观察siRNA干扰后48h,SK-Hep-1细胞中CIT表达的变化情况。用EdU细胞增殖实验检测siRNA干扰后48h对SK-Hep-1细胞增殖的影响。两样本均数间比较采用t检验,多样本均数间比较采用单因素方差分析。结果3条针对不同靶点的干扰序列,蛋白质印迹法检测结果显示,相较于对照组,敲低1、2、3组CIT蛋白的表达水平均降低(P<0.01),而敲低1组蛋白表达量最低。Real-timePCR检测结果显示,相较于对照组,敲低1、2、3组CITmRNA表达水平均降低(P<0.01),而敲低1组mRNA表达量最低。激光共聚焦显微镜从形态学上也证实转染siRNA之后,CIT的表达明显减弱。EdU增殖实验结果显示,转染CIT的siRNA将明显减弱SK-Hep-1肝癌细胞的增殖(P<0.05)。结论成功筛选并合成能有效抑制SK-Hep-1肝癌细胞中CIT基因表达的siRNA片段,且能明显抑制SK-Hep-1细胞的增殖。

摘要：构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P<0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P<0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P<0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P<0.01)、0.110±0.022(P<0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。

摘要：目的 在对乙型肝炎病毒非结构蛋白HBx研究的过程中,发现体外表达HBx蛋白产物的稳定性存在差异.为了了解其中的原因,拟通过原核表达方式进行分析.方法 以包含全长HBV DNA的质粒pEco63为模板,通过PCR反应,扩增HBV X基因全长序列（1～154氨基酸）和截短序列（48～104氨基酸,48～146氨基酸,98～146氨基酸）,将这几种不同长度和位置的HBX DNA序列克隆到pGEX4T-2原核表达载体中,并通过下游引物设计中引入6×组氨酸标签序列.结果 最终成功构建N端融合GST蛋白标签序列和C端融合6×组氨酸标签序列的4种HBx重组表达载体.将4种包含不同长度HBx的重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta,培养至菌液浓度A值大约0.6左右,加入终浓度0.1 mmol/L的IPTG进行诱导表达.提取全菌蛋白通过Western印迹对HBx各重组蛋白产物的N端和C端进行检测.结论 在分段表达的HBx重组蛋白中发生了多处局部的断裂,而断裂部位主要集中于GST蛋白上.而造成这一结果的原因可能与HBx蛋白功能区域暴露后与GST相互作用有关.

摘要：目的建立针对Hendra病毒N基因的一步法RealtimeRT-PCR检测方法，用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量。方法针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针，构建体外转录的RNA片段作为标准品，建立一步法Real-timeRT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株。本研究建立的一步法Real-timeRT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒，不与Nipah病毒产生交叉反应。检测灵敏度为2．6×10^0～2．6×10^1 copies／μl。标准曲线的线性范围为2．6×10^1-2．6×10^7 copies／μl。结论本研究建立的一步法Real-time RT—PCR方法敏感性和特异性较高，且不易出现污染引起的假阳性结果，适合用于Hendra病毒感染样本的检测。

摘要：根据汉坦病毒76-118株M基因和β3整合素基因序列设计引物,分别以质粒M56和Hela细胞cDNA为模板通过PCR扩增和基因重组获得G2蛋白膜外区81～140片段的GST融合表达质粒以及β3整合素膜外区23～133片段FLAG融合表达质粒。通过SDS-PAGE检测G2片段在BL21表达菌中诱导表达及纯化的效果,Western blot检测β3整合素片段在真核细胞中的表达。将在BL21裂解上清中表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81～140)纯化后与经过GST蛋白预处理的含有β3整合素片段的细胞裂解上清进行孵育,同时以未做任何转染的HEK293细胞裂解上清和无关蛋白GST-TLM作为阴性对照,通过GSTPull-down验证G2蛋白与β3整合素之间的相互作用。结果显示在Pull-down所获蛋白复合物中检测到β3整合素27～133位氨基酸片段产物的存在。结果表明G2蛋白与β3整合素之间可能存在有直接的相互作用,为β3整合素作为汉坦病毒细胞膜受体提供了进一步证据。

摘要：目的:研究乙肝病毒(HBV)感染者HBV基因型分布状况,并建立一套HBV病毒株分型的简便可靠的分析法。方法:设计型特异引物,采用基因型特异引物聚合酶链反应(PCR)法分型。结果:238株HBV中218株得到分型。其中B型149例(男115例、女34例);C型63例(男47例、女16例);B+C混合型6例(男4例、女2例)。B型、C型和B+C混合型检出率分别为68.3%(男69.3%、女65.3%)、28.9%(男28.3%、女30.8%)和2.8%(男2.4%、女3.8%)。未检出A、D、E、F、G、H基因型。结论:HBV感染者以B基因型为主。基因型B检出率显著高于其它基因型,其差异具有统计学意义(P0.01)。

摘要：目的:克隆中国人MxA基因并构建含有MxA基因的重组腺病毒载体,为下一步应用其进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定基础。方法:从健康中国人外周血中分离单个核细胞,用Trizol试剂提取总RNA。应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的引物扩增全序列MxA基因,应用基因克隆技术将MxA基因克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack(携带有绿色荧光蛋白基因)中,将线性化的pAdTrack-MxA和腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同电转化入新鲜感受态大肠杆菌BJ5183中,两者在其中完成同源重组,MxA重组腺病毒质粒经卡那霉素抗性鉴别和PacI酶切确证,验证正确的MxA重组腺病毒线性化转染入293细胞中包装成完整病毒颗粒,观察绿色荧光蛋白(GFP)表达并检测重组腺病毒的病毒滴度。结果:重组腺病毒穿梭质粒pAd-Track-MxA连接成功,测序结果表明克隆的MxA基因序列与GenBank中人MxA基因序列仅有5个核苷酸不同但所编码氨基酸仅1个发生改变,且此氨基酸位于非功能区。MxA重组腺病毒经PacI酶切后产生30kb和4.5kb大小2个片段表明同源重组成功。重组腺病毒经293细胞包装后可观察到绿色荧光,收获病毒并测感染滴度为1.59×108(pfu/ml),具有较高感染效率。结论:我们已成功克隆了中国人的MxA基因,并成功构建重组腺病毒质粒,为进一步应用此基因进行抗乙型肝炎基因治疗研究奠定了基础。

摘要：目的:筛选汉坦病毒包膜糖蛋白G2可能的候选受体或受体辅助分子,方法:根据汉坦病毒76～118株M基因序列设计引物,PCR扩增和基因重组获得G2全长及各功能片段的GST融合表达质粒,SDS-PAGE检测它们在BL21菌中诱导表达及纯化的效果。生物素标记汉坦病毒易感细胞Vero E6和非允许细胞CHO的细胞膜蛋白。将在BL21裂解上清中有表达的G2蛋白N端81～140位氨基酸片段(G2N81-140)纯化后与含有生物素标记的Vero E6细胞膜裂解液进行孵育,同时以非允许细胞CHO和无关蛋白GST-TLM做为阴性对照,通过GST Pull-down分离与G2蛋白特异性结合的细胞膜蛋白。结果:一个约30kD的Vero E6细胞膜蛋白与G2N81～140片段之间存在着特异性的相互作用。结论:该30kD蛋白可能是汉坦病毒细胞膜候选受体或受体辅助分子之一,是病毒入侵细胞的一个相关分子。