摘要：背景:瘦素是脂肪组织产生的一种激素,具有广泛的生理作用,也是近年能量代谢研究的热点之一,所用瘦素主要是大肠杆菌的表达产物,后者以不溶解的包含体形式存在,需要通过烦琐的复性过程才能获得具有生物学活性的人瘦素。目的:为获得天然溶解形式的人瘦素,探索其非亲和层析纯化条件,为进一步可能的产业化提供依据。设计:实验观察。单位:一所医学院的生化教研室分子生物学实验室。材料:选择强阴离子交换剂(SepharoseQ)和疏水介质(PhenylSepharose6)在不同条件下进行层析的方法,以尽可能除去样品中的杂质。方法:将培养获得的上清液在pH7.5的条件下首先经过Q柱柱层析纯化,收集目的蛋白;随后在高盐犤mol/L(NH4)2SO4犦状态下通过疏水层析进一步纯化。主要观察指标:经凝胶扫描分析,纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42.3%,Q柱柱层析纯化后纯度达到89.6%,疏水层析进一步纯化后纯度达到96.2%。结果:纯化产物在SDS-PAGE上呈现单一条带。经凝胶扫描分析,纯化前的培养上清液人瘦素纯度为42.3%,Q柱柱层析纯化后纯度达到89.6%,疏水层析进一步纯化后纯度达到96.2%。结论:通过强阳离子交换层析和疏水层析的合并应用,可将毕赤酵母表达系统表达的人瘦素进行有效纯化,纯度可达镍柱亲和层析的纯化结果,为进一步可能的产业化生产?

摘要：背景:肌钙蛋白Ⅰ能抑制血管内皮细胞生长、抑制新生血管形成并通过阻断新血管的生长而抑制实体瘤生长与转移的物质。肌钙蛋白C与肌钙蛋白Ⅰ类似,也存在于非肌肉组织中,其是否也具有肌钙蛋白Ⅰ类似的抗肿瘤作用?目的:观察重组人肌钙蛋白C对人脐静脉内皮细胞生长及小鼠异体移植肿瘤生长的作用。设计:体外及体内对比观察。单位:重庆康尔威药业股份有限公司药物研究所,重庆医科大学生化教研室。材料:实验于2003-03/2004-12在重庆康尔威药业股份有限公司药物研究所生物化学实验室完成。选用100只昆明种小鼠,雌雄不拘,体质量15～22g,购自重庆中药研究院。表达人骨骼肌型肌钙蛋白C的大肠杆菌工程菌株由重庆康尔威药业股份有限公司提供;人脐静脉内皮细胞(购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所)。方法:通过PCR技术从人胸腺cDNA文库中获取编码人骨骼肌型肌钙蛋白C的编码基因cDNA序列并克隆至大肠杆菌中获得表达人肌钙蛋白C的基因工程菌,用镍柱亲和层析纯化重组人肌钙蛋白C。①体外细胞实验:将人脐静脉内皮细胞以2×103cell/孔的密度置于96孔平板培养,将1,5,10,50mg/L的重组人肌钙蛋白C加入细胞培养液共同培养3d,使用酶标仪在540nm波长下测定A值,计算细胞生长抑制率,同时采用LOGIT法计算半数抑制率。②体内动物实验:取接种7～8d腹水瘤,将瘤细胞稀释至1×1010L-1后,0.2mL腋下及腹腔接种小鼠,每种接种方式各50只,次日采用随机摸球法将两种注射方式的小鼠分成5组,分别为重组人肌钙蛋白C20,10,5mg/kg组,环磷酰胺组及对照组,每组10只。重组人肌钙蛋白C20,10,5mg/kg组分别给予相应剂量重组人肌钙蛋白C1次,连续给药7d,环磷酰胺组间日给药50mg/kg环磷酰胺1次,对照组给予相应体积生理盐水,末次给药后停药1d,脱颈处死小鼠,称体质量,剖瘤称质量,按下列公式计算肿瘤抑制率:肿瘤抑制率=[(对照组平均瘤质量-药物组平均瘤质量)/对照组平均瘤质量]×100%。主要观察指标:体外细胞实验重组人肌钙蛋白C对人脐静脉内皮细胞生长及小鼠异体移植肿瘤的生长抑制率。结果:①体外细胞培养显示,重组人肌钙蛋白C对人脐静脉内皮细胞的生长呈剂量依赖性抑制,半数抑制率约7.5mg/L。②与体外细胞实验结果类似,腹腔给药后,重组人肌钙蛋白C5,10,20mg/kg组肿瘤抑制率高于对照组(P0.05)。结论:重组人肌钙蛋白C对人脐静脉内皮细胞的生长呈剂量依赖性抑制,其具有抑制血管内皮细胞生长作用与抗肿瘤作用。