摘要：目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,并观察其转染效率。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,将其定向克隆到真核表达载体pGenesil-1中,酶切和测序后,用脂质体转染到HEK293细胞中,用荧光显微镜和流式细胞仪观察荧光表达,鉴定转染效率。结果与结论成功构建4条表达shRNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞系中,转染效率达50%以上。

摘要：目的构建针对人黑色素浓集激素受体2(MCHR2)的shRNA真核表达载体,并在人胚肾293(HEK293)细胞中观察其对MCHR2基因表达的影响。方法根据MCHR2基因序列,设计并合成特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染到HEK293细胞中,观察其在mRNA和蛋白水平对MCHR2的影响。结果通过酶切鉴定和序列测定,成功构建四条表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功转染到HEK293细胞株中。四条shRNA真核表达载体在mRNA水平对MCHR2抑制率分别为54.9%、66.4%、56.9%、45.8%;在蛋白水平对MCHR2抑制率分别为62.0%、81.0%、73.3%、44.2%。结论针对人MCHR2的shRNA真核表达载体成功构建及鉴定为进一步研究MCHR2功能奠定了良好的基础。

摘要：目的构建人Makorin环指蛋白1(MKRN1)基因shRNA真核表达质粒,并检测其对HEK293细胞MKRN1基因表达的影响。方法设计并合成特异性针对人MKRN1基因的小干扰片段,定向克隆至带有卡那霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切鉴定及DNA序列分析,并用脂质体将其转染到HEK293细胞中,观察其对细胞MKRN1基因mRNA转录和蛋白表达水平的影响。结果经酶切鉴定和序列分析证明,3个人MKRN1基因shRNA真核表达质粒及其阴性对照质粒构建正确,转染HEK293细胞后,3个shRNA真核表达质粒在mRNA水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为52.4%、26.2%和42.9%,在蛋白水平对细胞MKRN1基因的抑制率分别为69.1%、27.9%和50.0%。结论已成功构建了人MKRN1基因的shRNA真核表达质粒,为进一步研究MKRN1基因的功能及其与人端粒酶逆转录酶的关系奠定了基础。

摘要：目的构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,并观察其对HeLa细胞中CD147基因表达的影响。方法根据GenBank中登录的人CD147基因序列,设计并合成针对CD147基因的特异性小干扰片段,并将其定向克隆至带有卡那霉素抗性和增强型绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定。用脂质体将重组质粒转染至HeLa细胞中,观察其对HeLa细胞CD147基因mRNA及蛋白表达水平的影响。结果酶切鉴定和测序结果表明,3个表达短发夹RNA的质粒及其阴性对照质粒构建正确。3个siRNA真核表达质粒对HeLa细胞CD147基因mRNA转录水平的抑制率分别为32.5%、66.8%和59.1%;对CD147蛋白表达水平的抑制率分别为28.3%、63.5%和56.2%。结论已成功构建针对人CD147基因的siRNA真核表达质粒,其对HeLa细胞CD147基因的表达具有明显的抑制作用,为进一步研究CD147基因的功能奠定了基础。

摘要：【目的】尝试构建表达小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)的小环载体,并初步鉴定其对乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)复制及其基因表达的抑制作用。【方法】设计并合成靶向HBV S区的siRNA,将其克隆到小环载体***-MCS2上,测序正确后将重组体pMC-H1-siHBS-U6转化入感受态***10P3S2T,然后在培养基中加入L-阿拉伯糖,诱导其降解细菌骨架,获取只含有目的基因表达盒的小环RNA干扰载体pmc-H1-siHBS-U6。将小环RNA干扰载体与HBV真核表达质粒pHBV1.3共转染Huh-7细胞,分别在转染后1-7天,ELISA法检测Huh-7细胞上清中的HBsAg、HBeAg,并且通过Real-time RT-PCR法分析干扰RNA对HBV DNA及mRNA的抑制效果。【结果】成功构建了靶向HBV S基因的siRNA小环表达载体pmc-H1-siHBS-U6。该载体能显著抑制Huh-7细胞HBsAg和HBeAg分泌,并且其抑制效果能够维持2-3周时间。Real-time PCR证实HBV的DNA与mRNA水平分别降低了71%和80%,而对照siRNA及空载体则无此作用。【结论】成功构建了靶向HBV的小环RNA干扰载体,并且其能稳定、高效、特异地抑制HBV基因的表达与复制,该研究不仅对探索HBV的基因治疗提供了重要线索,而且为RNA干扰的应用提供了新的运载体系。

摘要：用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得轮状病毒VP4基因。根据Genbank中鼠VP4基因的序列设计34对引物,用overlap PCR法合成VP4全基因的两个片段A、B,将A、B分别连入pMD19-T simple载体,测序结果显示,成功合成了VP4全基因。证明了重叠延伸PCR法是获得目的基因的有效方法。

摘要：血清蛋白室温下进行醋酸纤维薄膜电泳时,点样线靠近阳极端则有蛋白朝阴极运动,低温下移动方向相同而速度变慢。兰色葡聚糖和溴酚兰在对应条件下电泳表明,主要是薄膜表面溶剂蒸发,造成缓冲液由两端朝中部补充而流动,从而改变了部分低荷质比血清蛋白的电泳行为。此异常现象证实缓冲液流动可改变蛋白质电泳行为,可用于验证电泳影响因素的设计性实验教学。

摘要：目的利用RNA干扰技术,以COX-2为靶基因,构建靶向COX-2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达质粒并进行鉴定分析。方法设计、合成1对COX-2编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,经退火形成互补双链,通过定向克隆至质粒pGenesil-1,构建shRNA真核表达载体。转化JM109大肠杆菌,提取质粒进行酶切鉴定和测序分析;RT-PCR和Western blot检测重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白表达的抑制效果。结果酶切证实目的DNA定向克隆至载体上,测序分析结果与目的序列相同。RT-PCR和Western blot结果显示,与未转染组比较,pshRNA-COX-2重组表达质粒对β-actin基因无明显影响,而对COX-2有明显抑制作用。COX-2mRNA和蛋白表达的抑制率分别为66.9%和50.3%。结论成功构建的靶向干扰COX-2基因重组质粒能够显著抑制COX-2基因表达。

摘要：根据CyclinE(细胞周期蛋白E)基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向(+797^+819)位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.

摘要：背景:结合肿瘤的分子靶向技术和纳米技术,制备出一种新的具有靶向作用的纳米载体,以达到对肿瘤更好靶向作用的目的。目的:制备表皮生长因子偶联牛血清白蛋白纳米载体,联合核素标记的c-erbB2反义寡脱氧核苷酸,体外观察人乳腺癌SK-BR3细胞对其摄取情况。设计、时间及地点:对比观察实验,于2006-09/2008-03在重庆医科大学生物化学和分子生物学教研室,重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心,重庆医科大学放射医学教研室完成。材料:牛血清白蛋白(生物技术级)由美国Amresco公司提供,表皮生长因子由英国PeproTech EC LTD提供,125I由成都中核高通同位素股份有限公司提供,寡脱氧核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。方法:采用超声乳化-化学交联及羧和反应制备表皮生长因子偶联白蛋白靶向纳米载体,通过核素标记示踪技术检测表皮生长因子偶联白蛋白靶向纳米载体的相关性质。主要观察指标:测量表皮生长因子靶向纳米载体荷载c-erbB2反义寡脱氧核苷酸的载药量、包封率及释药率,人乳腺癌SK-BR3细胞对表皮生长因子靶向纳米载体的摄取率及滞留率。结果:表皮生长因子靶向纳米载体包载125I标记的反义寡脱氧核苷酸组的摄取率及滞留率高于正义寡脱氧核苷酸组和无义寡脱氧核苷酸组。同时c-erbB2寡脱氧核苷酸使用纳米载体荷载组的摄取率及滞留率均高于未使用纳米载体组,差异有显著性意义(P<0.05)。结论:125I标记的表皮生长因子靶向纳米载体能够提高乳腺癌SK-BR3细胞对c-erbB2反义寡脱氧核苷酸的摄取和滞留,能达到更好的靶向作用。