摘要：利用一种快速简便经济直接的筛选特异RNA干扰序列的方法,筛选结缔组织生长因子(CTGF)基因特异RNA干扰序列.设计合成分别含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,以pTM1-CTGF为模板PCR获得CTGF基因,定向克隆入pSOS-HUS质粒得到质粒pSOS-HUS-CTGF.质粒pSOS-HUS-CTGF经过SfiⅠ酶切后分别与5条CTGF干扰序列和1条随机对照序列克隆获得pSOS-CTGFi1,pSOS-CTGFi2,pSOS-CTGFi3,pSOS-CTGFi4,pSOS-CTGFi5,pSOS-CTGFicontrol.质粒转入HEK293细胞中,于第1、3、5、7d倒置荧光显微镜照相,IPP图像分析软件测定光强度值.5种CTGF特异RNA干扰载体的相对光强度分别为0.24%、41.47%、2.93%、20.40%和28.85%.特异性序列site1和site3的沉默效果最好.pSOS-HUS系统采用双向启动子,通过绿色荧光蛋白下调水平来衡量干扰序列的沉默效果具有可靠直观重复性好的优点.利用该方法成功筛选了高沉默效果的CTGF特异RNA干扰序列.

摘要：背景:血红素加氧酶1在防止和减轻缺血再灌注损伤方面扮演着重要角色,成为目前肝移植领域的研究热点。目的:构建重组腺病毒Ad5-血红素加氧酶1,对肝移植供体进行预处理来诱导供肝血红素加氧酶1高表达,进一步观察其对减体积肝移植大鼠生存时间及肝功能的影响。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2003-09/2005-03在重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所完成。材料:选用SD大鼠74只,制备原位减体积肝移植模型。方法:利用分子生物学方法构建携带有血红素加氧酶1基因的重组腺病毒Ad5-血红素加氧酶1,对供体进行预处理。将74只大鼠按不同处理方案分组如下:生理盐水组(n=12)、诱导剂原卟啉钴组(n=13)、Ad5-血红素加氧酶1组(n=13)、Ad5-绿色荧光蛋白组(n=12)、Ad5-血红素加氧酶1+抑制剂原卟啉锌组(n=12)分别于取肝前注射生理盐水、诱导剂原卟啉钴、Ad5-血红素加氧酶1、Ad5-绿色荧光蛋白及Ad5-血红素加氧酶1+抑制剂原卟啉锌,取肝后HTK液4℃保存24h后植入。对照组(n=12)取肝前48h静脉注射生理盐水,取肝后马上植入。主要观察指标:各组肝移植大鼠的存活率,肝功能指标测定,彩色多普勒超声监测移植后2h门静脉血流变化,应用常规苏木精-伊红染色法观察移植肝组织病理学变化,肝组织血红素加氧酶1活性测定,应用免疫组织化学染色法检测血红素加氧酶1、肿瘤坏死因子α,bcl-2,bax在移植肝组织中的表达,从分子水平检测血红素加氧酶1、肿瘤坏死因子α,bcl-2,baxmRNA的表达变化。结果:Ad5-血红素加氧酶1组大鼠肝移植后1,7,21d的生存率显著高于生理盐水组(P<0.05)。与生理盐水组、Ad5-绿色荧光蛋白组及Ad5-血红素加氧酶1+抑制剂原卟啉锌组比较,Ad5-血红素加氧酶1组移植肝的谷丙转氨酶活性显著降低(P<0.05),移植后2h内门静脉血流量明显增加(P<0.05),血红素加氧酶1活性显著升高(P<0.05),反转录-聚合酶链反应和免疫组化检测中血红素加氧酶1、Bcl-2表达水平增高(P<0.05),Bax、肿瘤坏死因子α表达水平降低(P<0.05)。结论:构建重组腺病毒Ad5-血红素加氧酶1可以诱导供肝血红素加氧酶1高表达,显著增加大鼠减体积肝移植后2h内门静脉血流,促进移植肝功能的恢复,从而延长肝移植后的生存时间。